第六章 色譜法
色譜的概念與分析特點
色譜理論
色譜分類
色譜儀器基本結(jié)構(檢測器)
色譜分析應用
色譜基礎知識
1.色譜分析特點：高靈敏度、高效能、高選擇性、快速度
2.色譜峰三參數(shù)：峰面積(定量)、峰位(定性)、峰寬(柱效)
色譜理論
分配系數(shù)、容量因子：k=K×(Vs/Vm)=(Cs/Cm)×(Vs/Vm) ;容量因子差異是色譜分離的先決條件;分配系數(shù)差異是物質(zhì)分離的前提。
兩個理論
速率理論：渦流擴散(小粒度均勻顆粒勻漿裝柱);傳質(zhì)阻抗(小粒度、低粘度、適當高溫);縱向擴散(限氣相色譜)
塔板理論：n=5.54(tR/Wh/2)2
H=L/n
色譜分離原理分類
吸附色譜：如薄層色譜
分配色譜：固定相為液體的液相、氣相色譜，最普遍
離子交換色譜：離子型物質(zhì)分離
分子排阻色譜：大分子物質(zhì)可利用分子大小不同而分離
薄層色譜
原理：利用A、B兩種物質(zhì)的KA≠KB而分離
固定相：硅膠(活化、G、H、F254)、硅藻土、氧化鋁、纖維素等
薄層板制備：1份固定相+3份水，同一方向研磨
點樣：距底邊2.0cm，樣點直徑2-4mm;
檢視：顯色、熒光
色譜系統(tǒng)適用性：靈敏度、比移值、分離度
應用
鑒別：比較Rf值是否一致
雜質(zhì)檢查：雜質(zhì)對照法、自身稀釋對照法
高效液相色譜法
原理：分配色譜、分子排阻色譜、離子交換…
分配色譜分類：
反相色譜(流動相極性大于固定相;極性強的先出柱;分離非極性和中等極性有機分子;固定相多為C18(ODS)和C8柱;流動相多為甲醇-水或乙腈-水;最廣泛);
正相色譜(流動相極性小于固定相;極性弱的先出柱;分離極性和中等極性有機分子)
儀器結(jié)構
高壓泵
色譜柱(固定相：C18烷基鍵合硅膠，流動相：甲醇-水或乙腈-水)
進樣閥
檢測器
濃度型：紫外檢測器、光電二極管陣列檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器、質(zhì)譜檢測器
質(zhì)量型：蒸發(fā)光散射檢測器、示差折光檢測器
色譜系統(tǒng)適用性
四參數(shù)：理論板數(shù)、分離度、重復性和拖尾因子
理論板數(shù)、分離度(R>1.5)、重復性(RSD≤2.0%)、拖尾因子(0.95-1.05)的計算公式
標準色譜分析方法中的固定因素：固定相種類、流動相組成、檢測器類型
應用
1.鑒別：比較tR
2.雜質(zhì)檢查
內(nèi)標法(公式)
外標法(公式)
加校正因子(需有雜質(zhì)對照品)和不加校正因子主成分自身對照
面積歸一化
3.含量測定
內(nèi)標法
外標法
氣相色譜法
原理：分配色譜，分離熱穩(wěn)定蒸汽壓大的物質(zhì)
儀器結(jié)構
氣源：氮、氦、氫
進樣：頂空進樣、直接進樣
色譜柱：填充柱和毛細管柱(開管型(涂壁WCOT或涂層SCOT);填充型);SCOT應用最多;色譜柱用前需老化
固定液與載體
固定液：烴類(角鯊烷，非極性)、硅氧烷(弱極性，應用最廣)、醇類(氫鍵型，聚乙二醇，藥物分析常用)
載體：硅藻土、多孔微球
檢測器：火焰離子化檢測器(FID)、電子捕獲檢測器(ECD，用于含鹵素、硫、氧、等電負性強基團)、質(zhì)譜檢測器(MS)、熱導檢測器(TCD)
應用(同液相色譜)
內(nèi)標法
外標法
標準加入法(消除樣本基質(zhì)的影響)
面積歸一化法
電泳法
原理：帶電荷物質(zhì)在電場下趟度差異而分離
影響因素：pH值和離子強度(緩沖液)、電場強度、樣品濃度1%
類型：平板電泳、毛細管電泳
應用
鑒別：肝素鈉乳膏鑒別：瓊脂糖凝膠電泳
分子量測定：注射用重組人促紅素:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
純度檢查：凍干人血白蛋白純度：醋酸纖維素薄膜電泳;肉毒抗毒素純度：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
等電點測定：注射用重組人白介素-2等電點：等電聚膠電泳
分子組分比測定：尿激酶分子組分比：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
色譜的概念與分析特點
色譜理論
色譜分類
色譜儀器基本結(jié)構(檢測器)
色譜分析應用
色譜基礎知識
1.色譜分析特點：高靈敏度、高效能、高選擇性、快速度
2.色譜峰三參數(shù)：峰面積(定量)、峰位(定性)、峰寬(柱效)
色譜理論
分配系數(shù)、容量因子：k=K×(Vs/Vm)=(Cs/Cm)×(Vs/Vm) ;容量因子差異是色譜分離的先決條件;分配系數(shù)差異是物質(zhì)分離的前提。
兩個理論
速率理論：渦流擴散(小粒度均勻顆粒勻漿裝柱);傳質(zhì)阻抗(小粒度、低粘度、適當高溫);縱向擴散(限氣相色譜)
塔板理論：n=5.54(tR/Wh/2)2
H=L/n
色譜分離原理分類
吸附色譜：如薄層色譜
分配色譜：固定相為液體的液相、氣相色譜，最普遍
離子交換色譜：離子型物質(zhì)分離
分子排阻色譜：大分子物質(zhì)可利用分子大小不同而分離
薄層色譜
原理：利用A、B兩種物質(zhì)的KA≠KB而分離
固定相：硅膠(活化、G、H、F254)、硅藻土、氧化鋁、纖維素等
薄層板制備：1份固定相+3份水，同一方向研磨
點樣：距底邊2.0cm，樣點直徑2-4mm;
檢視：顯色、熒光
色譜系統(tǒng)適用性：靈敏度、比移值、分離度
應用
鑒別：比較Rf值是否一致
雜質(zhì)檢查：雜質(zhì)對照法、自身稀釋對照法
高效液相色譜法
原理：分配色譜、分子排阻色譜、離子交換…
分配色譜分類：
反相色譜(流動相極性大于固定相;極性強的先出柱;分離非極性和中等極性有機分子;固定相多為C18(ODS)和C8柱;流動相多為甲醇-水或乙腈-水;最廣泛);
正相色譜(流動相極性小于固定相;極性弱的先出柱;分離極性和中等極性有機分子)
儀器結(jié)構
高壓泵
色譜柱(固定相：C18烷基鍵合硅膠，流動相：甲醇-水或乙腈-水)
進樣閥
檢測器
濃度型：紫外檢測器、光電二極管陣列檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器、質(zhì)譜檢測器
質(zhì)量型：蒸發(fā)光散射檢測器、示差折光檢測器
色譜系統(tǒng)適用性
四參數(shù)：理論板數(shù)、分離度、重復性和拖尾因子
理論板數(shù)、分離度(R>1.5)、重復性(RSD≤2.0%)、拖尾因子(0.95-1.05)的計算公式
標準色譜分析方法中的固定因素：固定相種類、流動相組成、檢測器類型
應用
1.鑒別：比較tR
2.雜質(zhì)檢查
內(nèi)標法(公式)
外標法(公式)
加校正因子(需有雜質(zhì)對照品)和不加校正因子主成分自身對照
面積歸一化
3.含量測定
內(nèi)標法
外標法
氣相色譜法
原理：分配色譜，分離熱穩(wěn)定蒸汽壓大的物質(zhì)
儀器結(jié)構
氣源：氮、氦、氫
進樣：頂空進樣、直接進樣
色譜柱：填充柱和毛細管柱(開管型(涂壁WCOT或涂層SCOT);填充型);SCOT應用最多;色譜柱用前需老化
固定液與載體
固定液：烴類(角鯊烷，非極性)、硅氧烷(弱極性，應用最廣)、醇類(氫鍵型，聚乙二醇，藥物分析常用)
載體：硅藻土、多孔微球
檢測器：火焰離子化檢測器(FID)、電子捕獲檢測器(ECD，用于含鹵素、硫、氧、等電負性強基團)、質(zhì)譜檢測器(MS)、熱導檢測器(TCD)
應用(同液相色譜)
內(nèi)標法
外標法
標準加入法(消除樣本基質(zhì)的影響)
面積歸一化法
電泳法
原理：帶電荷物質(zhì)在電場下趟度差異而分離
影響因素：pH值和離子強度(緩沖液)、電場強度、樣品濃度1%
類型：平板電泳、毛細管電泳
應用
鑒別：肝素鈉乳膏鑒別：瓊脂糖凝膠電泳
分子量測定：注射用重組人促紅素:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
純度檢查：凍干人血白蛋白純度：醋酸纖維素薄膜電泳;肉毒抗毒素純度：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
等電點測定：注射用重組人白介素-2等電點：等電聚膠電泳
分子組分比測定：尿激酶分子組分比：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳