免疫印跡法（immunoblotting test，IBT）亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法（EITB），因與Southern早先建立的檢測(cè)核酸的印跡方法Southernblot相類似，亦被稱為Western blot.免疫印跡法（圖4-10-3）分三個(gè)階段進(jìn)行。第一階段為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）?？乖鹊鞍讟悠方?jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯胺凝膠中從陰極向陽泳動(dòng)，分子量越小，泳動(dòng)速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶）。第二階段為電轉(zhuǎn)移。將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（1OOV）和大電流（1～2A），通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此分階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見。第三階段為酶免疫定位。將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜（相當(dāng)于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（呈棕色）和4-氯-l-萘酚（呈藍(lán)紫色）。