摘要：本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谘芯磕M微重力環(huán)境對(duì)鼠源神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）粘附能力以及Ca2+-ATPase 活性的影響，探討微重力環(huán)境對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞互相聯(lián)系，細(xì)胞穩(wěn)定性的影響。實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取新生1 天SD 大鼠海馬組織來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞，原代培養(yǎng)7 天后一組置于回旋器中模擬微重力環(huán)境，另一組作為正常重力對(duì)照組，在1-5 天內(nèi)對(duì)兩組細(xì)胞分別取樣，通過(guò)倒置顯微鏡觀察1-5 天內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞聚集成球大小直徑，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)粘附相關(guān)分子整合素的表達(dá)量以及蛋白酶法檢測(cè)Ca2+-ATPase 活性變化。結(jié)果顯示模擬微重力環(huán)境中NSCs 細(xì)胞成球直徑，整合素的表達(dá)量以及Ca2+-ATPase 活性均明顯大于正常重力對(duì)照組。因此，微重力環(huán)境能夠增強(qiáng)NSCs 細(xì)胞的粘附能力，提高Ca2+-ATPase 活性，有助于細(xì)胞相互聯(lián)系。
關(guān)鍵詞：模擬微重力；神經(jīng)干細(xì)胞；粘附能力
1 引 言
太空是一個(gè)高真空、超低溫和微重力的環(huán)境,在太空中由于所有物體都表現(xiàn)不出重量,細(xì)胞的性狀會(huì)發(fā)生各種變化,進(jìn)而影響其結(jié)構(gòu)和功能。動(dòng)物細(xì)胞在微重力環(huán)境下會(huì)發(fā)生顯著的變化。這些變化包括細(xì)胞形態(tài)、分子內(nèi)部應(yīng)力等的調(diào)整與改變。在哺乳動(dòng)物中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)能夠協(xié)調(diào)和整合機(jī)體多種生命活動(dòng)，在各大系統(tǒng)中處于核心地位。在動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中，重力因素一直參與其中，但其發(fā)揮的作用及其機(jī)制并不明確。神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstem cells，NSCs）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有自我更新能力和多種分化潛能的特殊細(xì)胞群，存在于胚胎和成年哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在一定條件下可以增殖、遷移并且分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育密切相關(guān)。整合素是細(xì)胞外基質(zhì)中重要的組成部分，是一種親異性細(xì)胞粘附分子，主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的粘附，或者是細(xì)胞與細(xì)胞間的粘附，并介導(dǎo)信號(hào)傳遞從而參與細(xì)胞的多種生理功能，如細(xì)胞的識(shí)別、生長(zhǎng)、分化、伸展與遷移、淋巴細(xì)胞的歸巢以及腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等方面。Ca2+是細(xì)胞內(nèi)的第二信使，在維持細(xì)胞內(nèi)各項(xiàng)生理活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用，而細(xì)胞內(nèi)外的鈣穩(wěn)態(tài)是鈣發(fā)揮生理效應(yīng)，保持細(xì)胞穩(wěn)定狀態(tài)的關(guān)鍵。Ca2+-ATPase 在維持細(xì)胞內(nèi)外Ca2+正常濃度中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)旨在研究模擬微重力環(huán)境對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞粘附能力以及Ca2+-ATPase活性的影響，為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。
2 材料和方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
DMEM/F12 培養(yǎng)基和B27 添加劑購(gòu)自Gibco 公司，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)購(gòu)自Peprotech 公司，DAPI、多聚賴氨酸、胎牛血清、免疫山羊血清、多聚甲醛、Triton- X100 均購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，Ca2+-ATPase 活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京縱橫洋洲醫(yī)藥生物有限公司，鼠抗integrins 和羊抗鼠IgG-FITC 均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為新生1天SD大鼠，購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。SM-31 雙軸驅(qū)動(dòng)框架式回轉(zhuǎn)器，中國(guó)科學(xué)院空間科學(xué)與應(yīng)用研究中心研制。
2.2 大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)
解剖新生一天的SD 大鼠，（提前埋入冰盒約30min）拿入超凈臺(tái)操作。解剖老鼠頭部并取出海馬組織放入盛有4℃ D-Hank’s 液的35mm 無(wú)菌培養(yǎng)皿中。待所有大鼠海馬組織都提取完畢，用移液器小心吸出D-Hank’s 液，用直頭鑷子剔除明顯的血管，再用直頭剪將組織剪碎至1mm3 左右的小塊。去掉D-Hank’s 液，直頭剪剪碎組織到1mm3 左右大小。加入組織消化液覆蓋組織塊，37℃消化10min。加入終止消化液并離心，2000rpm 離心5min，棄去上清，用DMEM/F12 培養(yǎng)基（2% B27，20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF，100U/ml 青霉素/鏈霉素）輕輕重懸起沉淀。待吹散均勻后用200 目不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾。臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃，5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3-4 天進(jìn)行半量換液。
2.3 模擬微重力環(huán)境的體系的建立
實(shí)驗(yàn)中采用 SM-31 雙軸驅(qū)動(dòng)框架式回轉(zhuǎn)器來(lái)模擬微重力條件，內(nèi)外框的轉(zhuǎn)速均為15rpm。將從SD 大鼠海馬組織來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)7 天，將其分為兩組，一組置于回轉(zhuǎn)器中作為模擬微重力組，另一組常態(tài)培養(yǎng)作為正常重力對(duì)照組。
2.4 倒置顯微鏡觀察NSCs 細(xì)胞聚集形態(tài)變化
將原代培養(yǎng) 7 天的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞平行分為模擬微重力組和正常重力對(duì)照組。在細(xì)胞生長(zhǎng)的1-5d 內(nèi)，每天對(duì)微重力和正常重力培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞取樣，倒置顯微鏡下觀察，并用Image pro plus 軟件對(duì)其直徑變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。
2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NSCs細(xì)胞表面粘附分子整合素β1 的表達(dá)量
將原代培養(yǎng) 7 天的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞平行分為模擬微重力組和正常重力對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)5 天。之后分別離心收取生長(zhǎng)5 天的神經(jīng)干細(xì)胞，室溫下4%多聚甲醛固定30min。PBS 洗3次，5 min/次。加入PBS稀釋的一抗（兔抗integrins）、10%山羊血清封閉液和0.3%Triton-X100于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h。PBS 洗3 次，10 min/次。加PBS 稀釋的二抗IgG-FITC，37℃避光孵育30min。PBS洗3次，5min/次。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。
2.6 蛋白酶法檢測(cè)NSCs 細(xì)胞Ca2+-ATPase 活性的影響
將原代培養(yǎng) 7 天的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞平行分為模擬微重力組和正常重力對(duì)照組。在細(xì)胞生長(zhǎng)的5 天內(nèi)，對(duì)每組細(xì)胞分別在1h，12h，24h，72h，120h 取樣，超聲破碎儀破碎細(xì)胞并離心，棄沉淀收集上清。上清液用考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量后，按照Ca2+-ATPase 活性試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定。
3 結(jié) 果
3.1 模擬微重力對(duì)鼠源神經(jīng)干細(xì)胞聚集能力的影響
連續(xù)5天從倒置顯微鏡中觀察細(xì)胞聚集情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模擬微重力環(huán)境中生長(zhǎng)的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞球明顯大于正常重力對(duì)照組，并且隨著生長(zhǎng)時(shí)間的不斷增加，差距更加明顯。模擬微重力環(huán)境和正常重力環(huán)境中生長(zhǎng)1-5d 的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞所形成的神經(jīng)球平均直徑結(jié)果顯示，正常重力環(huán)境中生長(zhǎng)1-5d 的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞球平均直徑的增幅約20μm 左右。而模擬微重力環(huán)境中生長(zhǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球的平均直徑在1-2d 內(nèi)的變化與正常重力環(huán)境中生長(zhǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球的平均直徑變化沒(méi)有明顯差別。而模擬微重力環(huán)境中生長(zhǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球的平均直徑在3-5d 內(nèi)的增幅在100μm 以上，明顯高于正常重力對(duì)照組。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示神經(jīng)干細(xì)胞在模擬微重力環(huán)境中更加容易聚集形成的神經(jīng)球。
（A）正常重力環(huán)境中生長(zhǎng)1 天的神經(jīng)干細(xì)胞球，×100；（B）模擬微重力環(huán)境中生長(zhǎng)1 天的神經(jīng)干細(xì)胞球，×100；（C）正常重力環(huán)境中生長(zhǎng)2 天的神經(jīng)干細(xì)胞球，×100；（D）模擬微重力環(huán)境中生長(zhǎng)2 天的神經(jīng)干細(xì)胞球，×100；（E）正常重力環(huán)境中生長(zhǎng)3 天的神經(jīng)干細(xì)胞球，×100；（F）模擬微重力環(huán)境中生長(zhǎng)3 天的神經(jīng)干細(xì)胞球，×100；（G）正常重力環(huán)境中生長(zhǎng)5 天的神經(jīng)干細(xì)胞球，×100；（H）模擬微重力環(huán)境中生長(zhǎng)5 天的神經(jīng)干細(xì)胞球，×100；
3.2 模擬微重力對(duì)NSCs 細(xì)胞表面粘附分子整合素β1 表達(dá)的影響
通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定整合素β1 表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在模擬微重力環(huán)境中培養(yǎng)5 天的鼠源神經(jīng)干細(xì)胞，其整合素的表達(dá)明顯高于正常重力對(duì)照組。
3.3 模擬微重力對(duì)NSCs 細(xì)胞Ca2+-ATPase 活性的影響
本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在24 小時(shí)之內(nèi)，模擬微重力環(huán)境中神經(jīng)干細(xì)胞的Ca2+-ATPase活性明顯高于正常重力對(duì)照組。在第二天開(kāi)始明顯微重力組Ca2+-ATPase 活性明顯降低，并在隨后的2-5 天之間，模擬微重力組Ca2+-ATPase 活性開(kāi)始逐漸降低，并與正常重力對(duì)照組無(wú)顯著差異。
4 討 論
神經(jīng)干細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)中一類(lèi)具有自我更新能力和多分化潛能的細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)球之間和神經(jīng)球內(nèi)部細(xì)胞之間存在著廣泛的異質(zhì)性。神經(jīng)球是神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)于含有有絲分裂原組織培養(yǎng)液中表現(xiàn)出的一般形式，該懸浮球狀細(xì)胞團(tuán)中的細(xì)胞被認(rèn)為保持了神經(jīng)干細(xì)胞的基本增殖和分化特性。研究證明神經(jīng)球并非神經(jīng)干細(xì)胞的單克隆群體，神經(jīng)球的發(fā)生除了細(xì)胞增殖外，還包括細(xì)胞重聚團(tuán)、神經(jīng)球融合等方式，其形成過(guò)程也有諸多因子參與影響。整合素（integrin）是細(xì)胞粘附分子中一類(lèi)重要的細(xì)胞表面受體家族，主要介導(dǎo)細(xì)胞與胞外基質(zhì)的粘附或者是介導(dǎo)細(xì)胞間的粘附，借此作為介導(dǎo)信號(hào)傳遞的膜分子并進(jìn)行一些列胞內(nèi)蛋白激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與細(xì)胞的多種生理功能。整合素在動(dòng)植物細(xì)胞中廣泛表達(dá)，是由α（120-185kD）和β（90-110kD）兩個(gè)亞單位形成的異二聚體。迄今已發(fā)現(xiàn)16 種α 亞單位和9 種β 亞單位，它們按不同的組合構(gòu)成20 余種整合素。其中含β1 亞單位的整合素主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分之間的粘附。Masini 等研究者發(fā)現(xiàn)，微重力環(huán)境可以使神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞整合素表達(dá)增強(qiáng)。細(xì)胞膜Ca2+-ATPase 通過(guò)分解ATP 將鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ca2+-ATPase 通過(guò)水解ATP 將細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)的鈣離子逆濃度梯度泵入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Ca2+-ATPase 是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的重要蛋白之一，其作用是將導(dǎo)致細(xì)胞收縮的胞漿Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中儲(chǔ)存，這是一個(gè)主動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)的過(guò)程，需要消耗ATP 提供能量，Ca2+-ATPase每轉(zhuǎn)運(yùn)兩個(gè)Ca2+需要消耗一分子大ATP。鈣離子是最重要的細(xì)胞內(nèi)信使之一，細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)定對(duì)維持細(xì)胞正常的生理生化過(guò)程至關(guān)重要。細(xì)胞內(nèi)Ca2+-ATPase 活性對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的穩(wěn)定性有重要作用，其活性會(huì)影響到細(xì)胞的許多生理功能及細(xì)胞的完整性。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模擬微重力環(huán)境中培養(yǎng)5 天的鼠源神經(jīng)干細(xì)胞，其細(xì)胞聚集形成的神經(jīng)球直徑明顯大于正常重力對(duì)照組。同時(shí)整合素β1 表達(dá)量增加。這提示模擬微重力環(huán)境能使細(xì)胞之間的粘附能力增強(qiáng)，細(xì)胞更容易聚集成球，細(xì)胞之間的聯(lián)系更加緊密，這就可能有助于細(xì)胞之間的相互聯(lián)系和信號(hào)傳導(dǎo)。短期模擬微重力環(huán)境能夠明顯提高大鼠神經(jīng)干細(xì)胞Ca2+-ATPase 活性，隨著天數(shù)的增加，模擬微重力環(huán)境中NSCs 的Ca2+-ATPase 活性開(kāi)始下降，并且與正常重力對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異。這有可能是細(xì)胞逐漸適應(yīng)微重力環(huán)境的表現(xiàn)。綜上所述，模擬微重力能夠增強(qiáng)NSCs 細(xì)胞的粘附能力并提高Ca2+-ATPase 的活性。本研究做了對(duì)模擬微重力環(huán)境對(duì)鼠源神經(jīng)干細(xì)胞粘附作用的初步探究，具體的原因及生物學(xué)效應(yīng)還有待進(jìn)一步的探究
關(guān)鍵詞：模擬微重力；神經(jīng)干細(xì)胞；粘附能力
1 引 言
太空是一個(gè)高真空、超低溫和微重力的環(huán)境,在太空中由于所有物體都表現(xiàn)不出重量,細(xì)胞的性狀會(huì)發(fā)生各種變化,進(jìn)而影響其結(jié)構(gòu)和功能。動(dòng)物細(xì)胞在微重力環(huán)境下會(huì)發(fā)生顯著的變化。這些變化包括細(xì)胞形態(tài)、分子內(nèi)部應(yīng)力等的調(diào)整與改變。在哺乳動(dòng)物中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)能夠協(xié)調(diào)和整合機(jī)體多種生命活動(dòng)，在各大系統(tǒng)中處于核心地位。在動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中，重力因素一直參與其中，但其發(fā)揮的作用及其機(jī)制并不明確。神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstem cells，NSCs）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有自我更新能力和多種分化潛能的特殊細(xì)胞群，存在于胚胎和成年哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在一定條件下可以增殖、遷移并且分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育密切相關(guān)。整合素是細(xì)胞外基質(zhì)中重要的組成部分，是一種親異性細(xì)胞粘附分子，主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的粘附，或者是細(xì)胞與細(xì)胞間的粘附，并介導(dǎo)信號(hào)傳遞從而參與細(xì)胞的多種生理功能，如細(xì)胞的識(shí)別、生長(zhǎng)、分化、伸展與遷移、淋巴細(xì)胞的歸巢以及腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等方面。Ca2+是細(xì)胞內(nèi)的第二信使，在維持細(xì)胞內(nèi)各項(xiàng)生理活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用，而細(xì)胞內(nèi)外的鈣穩(wěn)態(tài)是鈣發(fā)揮生理效應(yīng)，保持細(xì)胞穩(wěn)定狀態(tài)的關(guān)鍵。Ca2+-ATPase 在維持細(xì)胞內(nèi)外Ca2+正常濃度中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)旨在研究模擬微重力環(huán)境對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞粘附能力以及Ca2+-ATPase活性的影響，為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。
2 材料和方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
DMEM/F12 培養(yǎng)基和B27 添加劑購(gòu)自Gibco 公司，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)購(gòu)自Peprotech 公司，DAPI、多聚賴氨酸、胎牛血清、免疫山羊血清、多聚甲醛、Triton- X100 均購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，Ca2+-ATPase 活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京縱橫洋洲醫(yī)藥生物有限公司，鼠抗integrins 和羊抗鼠IgG-FITC 均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為新生1天SD大鼠，購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。SM-31 雙軸驅(qū)動(dòng)框架式回轉(zhuǎn)器，中國(guó)科學(xué)院空間科學(xué)與應(yīng)用研究中心研制。
2.2 大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)
解剖新生一天的SD 大鼠，（提前埋入冰盒約30min）拿入超凈臺(tái)操作。解剖老鼠頭部并取出海馬組織放入盛有4℃ D-Hank’s 液的35mm 無(wú)菌培養(yǎng)皿中。待所有大鼠海馬組織都提取完畢，用移液器小心吸出D-Hank’s 液，用直頭鑷子剔除明顯的血管，再用直頭剪將組織剪碎至1mm3 左右的小塊。去掉D-Hank’s 液，直頭剪剪碎組織到1mm3 左右大小。加入組織消化液覆蓋組織塊，37℃消化10min。加入終止消化液并離心，2000rpm 離心5min，棄去上清，用DMEM/F12 培養(yǎng)基（2% B27，20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF，100U/ml 青霉素/鏈霉素）輕輕重懸起沉淀。待吹散均勻后用200 目不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾。臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃，5% CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3-4 天進(jìn)行半量換液。
2.3 模擬微重力環(huán)境的體系的建立
實(shí)驗(yàn)中采用 SM-31 雙軸驅(qū)動(dòng)框架式回轉(zhuǎn)器來(lái)模擬微重力條件，內(nèi)外框的轉(zhuǎn)速均為15rpm。將從SD 大鼠海馬組織來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)7 天，將其分為兩組，一組置于回轉(zhuǎn)器中作為模擬微重力組，另一組常態(tài)培養(yǎng)作為正常重力對(duì)照組。
2.4 倒置顯微鏡觀察NSCs 細(xì)胞聚集形態(tài)變化
將原代培養(yǎng) 7 天的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞平行分為模擬微重力組和正常重力對(duì)照組。在細(xì)胞生長(zhǎng)的1-5d 內(nèi)，每天對(duì)微重力和正常重力培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞取樣，倒置顯微鏡下觀察，并用Image pro plus 軟件對(duì)其直徑變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。
2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NSCs細(xì)胞表面粘附分子整合素β1 的表達(dá)量
將原代培養(yǎng) 7 天的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞平行分為模擬微重力組和正常重力對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)5 天。之后分別離心收取生長(zhǎng)5 天的神經(jīng)干細(xì)胞，室溫下4%多聚甲醛固定30min。PBS 洗3次，5 min/次。加入PBS稀釋的一抗（兔抗integrins）、10%山羊血清封閉液和0.3%Triton-X100于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h。PBS 洗3 次，10 min/次。加PBS 稀釋的二抗IgG-FITC，37℃避光孵育30min。PBS洗3次，5min/次。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。
2.6 蛋白酶法檢測(cè)NSCs 細(xì)胞Ca2+-ATPase 活性的影響
將原代培養(yǎng) 7 天的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞平行分為模擬微重力組和正常重力對(duì)照組。在細(xì)胞生長(zhǎng)的5 天內(nèi)，對(duì)每組細(xì)胞分別在1h，12h，24h，72h，120h 取樣，超聲破碎儀破碎細(xì)胞并離心，棄沉淀收集上清。上清液用考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量后，按照Ca2+-ATPase 活性試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定。
3 結(jié) 果
3.1 模擬微重力對(duì)鼠源神經(jīng)干細(xì)胞聚集能力的影響
連續(xù)5天從倒置顯微鏡中觀察細(xì)胞聚集情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模擬微重力環(huán)境中生長(zhǎng)的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞球明顯大于正常重力對(duì)照組，并且隨著生長(zhǎng)時(shí)間的不斷增加，差距更加明顯。模擬微重力環(huán)境和正常重力環(huán)境中生長(zhǎng)1-5d 的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞所形成的神經(jīng)球平均直徑結(jié)果顯示，正常重力環(huán)境中生長(zhǎng)1-5d 的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞球平均直徑的增幅約20μm 左右。而模擬微重力環(huán)境中生長(zhǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球的平均直徑在1-2d 內(nèi)的變化與正常重力環(huán)境中生長(zhǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球的平均直徑變化沒(méi)有明顯差別。而模擬微重力環(huán)境中生長(zhǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球的平均直徑在3-5d 內(nèi)的增幅在100μm 以上，明顯高于正常重力對(duì)照組。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示神經(jīng)干細(xì)胞在模擬微重力環(huán)境中更加容易聚集形成的神經(jīng)球。
（A）正常重力環(huán)境中生長(zhǎng)1 天的神經(jīng)干細(xì)胞球，×100；（B）模擬微重力環(huán)境中生長(zhǎng)1 天的神經(jīng)干細(xì)胞球，×100；（C）正常重力環(huán)境中生長(zhǎng)2 天的神經(jīng)干細(xì)胞球，×100；（D）模擬微重力環(huán)境中生長(zhǎng)2 天的神經(jīng)干細(xì)胞球，×100；（E）正常重力環(huán)境中生長(zhǎng)3 天的神經(jīng)干細(xì)胞球，×100；（F）模擬微重力環(huán)境中生長(zhǎng)3 天的神經(jīng)干細(xì)胞球，×100；（G）正常重力環(huán)境中生長(zhǎng)5 天的神經(jīng)干細(xì)胞球，×100；（H）模擬微重力環(huán)境中生長(zhǎng)5 天的神經(jīng)干細(xì)胞球，×100；
3.2 模擬微重力對(duì)NSCs 細(xì)胞表面粘附分子整合素β1 表達(dá)的影響
通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定整合素β1 表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在模擬微重力環(huán)境中培養(yǎng)5 天的鼠源神經(jīng)干細(xì)胞，其整合素的表達(dá)明顯高于正常重力對(duì)照組。
3.3 模擬微重力對(duì)NSCs 細(xì)胞Ca2+-ATPase 活性的影響
本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在24 小時(shí)之內(nèi)，模擬微重力環(huán)境中神經(jīng)干細(xì)胞的Ca2+-ATPase活性明顯高于正常重力對(duì)照組。在第二天開(kāi)始明顯微重力組Ca2+-ATPase 活性明顯降低，并在隨后的2-5 天之間，模擬微重力組Ca2+-ATPase 活性開(kāi)始逐漸降低，并與正常重力對(duì)照組無(wú)顯著差異。
4 討 論
神經(jīng)干細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)中一類(lèi)具有自我更新能力和多分化潛能的細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)球之間和神經(jīng)球內(nèi)部細(xì)胞之間存在著廣泛的異質(zhì)性。神經(jīng)球是神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)于含有有絲分裂原組織培養(yǎng)液中表現(xiàn)出的一般形式，該懸浮球狀細(xì)胞團(tuán)中的細(xì)胞被認(rèn)為保持了神經(jīng)干細(xì)胞的基本增殖和分化特性。研究證明神經(jīng)球并非神經(jīng)干細(xì)胞的單克隆群體，神經(jīng)球的發(fā)生除了細(xì)胞增殖外，還包括細(xì)胞重聚團(tuán)、神經(jīng)球融合等方式，其形成過(guò)程也有諸多因子參與影響。整合素（integrin）是細(xì)胞粘附分子中一類(lèi)重要的細(xì)胞表面受體家族，主要介導(dǎo)細(xì)胞與胞外基質(zhì)的粘附或者是介導(dǎo)細(xì)胞間的粘附，借此作為介導(dǎo)信號(hào)傳遞的膜分子并進(jìn)行一些列胞內(nèi)蛋白激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與細(xì)胞的多種生理功能。整合素在動(dòng)植物細(xì)胞中廣泛表達(dá)，是由α（120-185kD）和β（90-110kD）兩個(gè)亞單位形成的異二聚體。迄今已發(fā)現(xiàn)16 種α 亞單位和9 種β 亞單位，它們按不同的組合構(gòu)成20 余種整合素。其中含β1 亞單位的整合素主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分之間的粘附。Masini 等研究者發(fā)現(xiàn)，微重力環(huán)境可以使神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞整合素表達(dá)增強(qiáng)。細(xì)胞膜Ca2+-ATPase 通過(guò)分解ATP 將鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ca2+-ATPase 通過(guò)水解ATP 將細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)的鈣離子逆濃度梯度泵入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Ca2+-ATPase 是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的重要蛋白之一，其作用是將導(dǎo)致細(xì)胞收縮的胞漿Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中儲(chǔ)存，這是一個(gè)主動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)的過(guò)程，需要消耗ATP 提供能量，Ca2+-ATPase每轉(zhuǎn)運(yùn)兩個(gè)Ca2+需要消耗一分子大ATP。鈣離子是最重要的細(xì)胞內(nèi)信使之一，細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)定對(duì)維持細(xì)胞正常的生理生化過(guò)程至關(guān)重要。細(xì)胞內(nèi)Ca2+-ATPase 活性對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的穩(wěn)定性有重要作用，其活性會(huì)影響到細(xì)胞的許多生理功能及細(xì)胞的完整性。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模擬微重力環(huán)境中培養(yǎng)5 天的鼠源神經(jīng)干細(xì)胞，其細(xì)胞聚集形成的神經(jīng)球直徑明顯大于正常重力對(duì)照組。同時(shí)整合素β1 表達(dá)量增加。這提示模擬微重力環(huán)境能使細(xì)胞之間的粘附能力增強(qiáng)，細(xì)胞更容易聚集成球，細(xì)胞之間的聯(lián)系更加緊密，這就可能有助于細(xì)胞之間的相互聯(lián)系和信號(hào)傳導(dǎo)。短期模擬微重力環(huán)境能夠明顯提高大鼠神經(jīng)干細(xì)胞Ca2+-ATPase 活性，隨著天數(shù)的增加，模擬微重力環(huán)境中NSCs 的Ca2+-ATPase 活性開(kāi)始下降，并且與正常重力對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異。這有可能是細(xì)胞逐漸適應(yīng)微重力環(huán)境的表現(xiàn)。綜上所述，模擬微重力能夠增強(qiáng)NSCs 細(xì)胞的粘附能力并提高Ca2+-ATPase 的活性。本研究做了對(duì)模擬微重力環(huán)境對(duì)鼠源神經(jīng)干細(xì)胞粘附作用的初步探究，具體的原因及生物學(xué)效應(yīng)還有待進(jìn)一步的探究