摘 要：以小菜蛾為材料，用SMART技術(shù)構(gòu)建了小菜蛾2齡幼蟲全長cDNA文庫，對文庫的部分序列進行測序及分析，結(jié)果表明該文庫原始庫容達到1.1×106，擴增庫容達到2.6×109，重組率達到92%，平均插入片段大小為1kb左右，文庫質(zhì)量達到要求。序列分析得到了小菜蛾的部分新基因，對第11號基因(GenBank登錄號：GU014922)表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析預測表明該基因可能為絲氨酸蛋白酶家族基因的一個新成員，參與小菜蛾體內(nèi)重要的代謝、免疫反應。該文庫的構(gòu)建為進一步研究小菜蛾功能基因奠定了基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞：小菜蛾；全長cDNA文庫；EST序列；序列分析；絲氨酸蛋白酶
小菜蛾（Plutella xylostella）屬鱗翅目菜蛾科昆蟲，主要為害十字花科蔬菜，給農(nóng)業(yè)造成嚴重損失。小菜蛾繁殖力很強，每年發(fā)生數(shù)代甚至數(shù)十代，加之化學農(nóng)藥的大量施用，因此抗藥性發(fā)展特別快（羅雁婕等,2008）。而現(xiàn)有的生物農(nóng)藥對小菜蛾的防治效果也不是十分理想，尤其對于老熟幼蟲期以后的害蟲藥效差、擊倒速度慢等也是當前部分生物農(nóng)藥存在的問題（李高平等，2006）。未來殺蟲劑的開發(fā)研制越來越趨向于依靠分子生物學技術(shù)的發(fā)展創(chuàng)新，通過研究目標害蟲的功能基因從而找到適合的靶標，研制出針對性更強、效果更好的新型生物農(nóng)藥或?qū)Νh(huán)境友好、高效低毒的化學農(nóng)藥（鄭冬梅,2006；邱德文,2007）。而cDNA文庫是發(fā)現(xiàn)新基因和研究基因功能的基礎(chǔ)工具，本研究擬利用SMART技術(shù)，構(gòu)建小菜蛾2齡幼蟲全長cDNA文庫，為研究與小菜蛾抗性形成、免疫等相關(guān)的重要的功能基因打下基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 材料和試劑：
1.1.1 材料：小菜蛾成蟲捕捉于重慶地區(qū)蔬菜地，在實驗室條件下飼養(yǎng)兩代，取2齡幼蟲作為供試材料。
1.1.2 主要試劑：Creator SMART cDNA Library Construction Kit 購自Clontech公司，TRIZOL試劑、T4 DNA連接酶購自Invitrogen公司，mRNA純化試劑盒、核酸共沉劑、sfiⅠ限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒、凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司。
1.1.3 引物序列根據(jù)Creator SMART cDNA Library Construction Kit使用說明書，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成：建庫引物①SMART IV Oligonucleotide 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3'②CDS III/3' PCR Primer 5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3'③5' PCR Primer 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'；檢驗引物①M13 Forward Primer5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'②M13 Reverse Primer 5'-AAACAGCTATGACCATGTTCA-3'
1.2 方法
1.2.1 總RNA 和 mRNA提?。喊凑誘RIZOL試劑使用說明操作，將提取的總RNA用65℃、100μL DEPC水溶解，取適量RNA溶液進行瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計檢測總RNA的質(zhì)量。然后用mRNA提取試劑盒從總RNA中提取mRNA，在最終的mRNA提取液中加入4%（V/V）核酸共沉劑，置-20℃沉淀過夜。第二天冰凍離心回收mRNA沉淀，用10μL DEPC水溶解mRNA沉淀備用。
1.2.2 dscDNA的合成與分級分離：根據(jù)Creator SMART cDNA Library Construction Kit使用說明書操作，以mRNA為模板,在CDS Ⅲ/ 3pPCR 引物和SMART Ⅳ寡核苷酸引物的引導下,通過逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA，再以第一鏈cDNA為模板,加入CDS Ⅲ/ 3p PCR 引物和5p錨定引物,用LA-Taq酶經(jīng)過LD-PCR(long distance polymerase chain reaction)合成第二鏈cDNA。反應結(jié)束后取5μLPCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖電泳檢測。將雙鏈cDNA以PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后加入適量sfiⅠ酶切掉引物兩端的序列，酶切后的雙鏈cDNA經(jīng)過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，回收500bp以上的片段。
1.2.3 dscDNA與載體連接后電轉(zhuǎn)化：用T4 DNA連接酶將cDNA與試劑盒中提供的載體按照一定比例相連接。按照一般感受態(tài)細胞制備的方法制備大腸桿菌XL1-BLUE感受態(tài)細胞，驗證轉(zhuǎn)化效率后，將cDNA與載體連接后的產(chǎn)物經(jīng)過初步純化后與感受態(tài)細胞混合進行電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)過復蘇后鋪板，37℃生長12h。
1.2.4 文庫驗證和保存：進行文庫庫容量的計算，隨機挑取單菌落進行菌落PCR，驗證文庫重組率及插入片段大小。用含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基洗平板上的菌落，混勻后加甘油速凍保存于-80℃。
1.2.5 EST測序及分析：隨機挑取60個單克隆分別接種于加氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床250rpm培養(yǎng)10h后加甘油保存菌種，將甘油菌送到南京金思特生物技術(shù)公司進行正向測序，測序引物為T7引物。將測序得到的EST序列用Crossmatch軟件去除載體序列，用phrap軟件對序列進行聚類拼接，處理后用NCBI的BlastX和BlastN程序進行相似性比對，并對序列進行GO注釋。
1.2.6 基因分析：根據(jù)基因相似性比對結(jié)果用NCBI在線預測基因表達蛋白的一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域，用SinglP在線預測基因表達產(chǎn)物的信號肽。
2 結(jié)果與分析
2.1 總RNA及mRNA質(zhì)量
總RNA經(jīng)過凝膠電泳分析表明28S和18S條帶清晰無拖尾，兩者亮度之比約為2:1，說明所提RNA完好無降解，紫外分光光度計檢測OD260/OD280=1.80～2.0，可以用來進行文庫構(gòu)建。從總RNA中純化得到的mRNA經(jīng)過紫外分光光度計檢測，OD260/OD280=1.80～2.0。
2.2 dscDNA
首先對dscDNA擴增程序進行了優(yōu)化，比較LD-PCR過程中18-30個循環(huán)的dscDNA擴增效果，得出21個循環(huán)的擴增效果，如圖2所示，電泳檢測dscDNA彌散分布于0.2kb～4.5kb，表明該時期轉(zhuǎn)錄的mRNA復雜多樣，其中分布的數(shù)條明顯條帶代表高豐度表達基因。擴增產(chǎn)物經(jīng)紫外檢測OD260/OD280=1.7～1.9。
2.3 文庫質(zhì)量
對文庫隨機挑取的單菌落進行菌落PCR，如圖3所示，凝膠電泳檢測結(jié)果顯示外源片段大小主要分布在0.75～1.5kb，外源片段插入率為92% ,平均長度為1kb左右。對文庫涂板后菌落數(shù)量的計算得到原始庫容為1.1×106，擴增后的庫容達到2.6×109，達到文庫的質(zhì)量要求（王昆等，2005）。
2.4 文庫測序及序列比對
隨機挑取的60個克隆測序后得到55條高質(zhì)量的EST序列，對這55條EST序列進行聚類分析及拼接后,共獲得30個非重復序列(UniGene)。非重復序列的長度在400～1200bp之間，平均在800bp左右。對這30條序列使用NCBI中的BlastX程序進行本地搜索,結(jié)果顯示：16條序列與Genebank中已公布的序列有較高同源性，并且這些同源序列多為昆蟲的基因；14條序列沒有注解。BlastN程序搜索結(jié)果表明：10條序列與Genebank公布的序列有較高同源性，20條序列沒有注解。這些沒有注解的序列為該物種新的EST序列，序列登錄工作正在進行中。
對30條非重復序列進行GO注釋，結(jié)果顯示：其中有16條序列參與各種分子功能、細胞組成和生物過程，占EST序列總數(shù)的53%，其表達產(chǎn)物包括核糖體蛋白、金屬蛋白、酶類等在內(nèi)的10多種產(chǎn)物，主要為核糖體蛋白、孵化酶、延伸因子等。
2.5 第11號基因（GenBank登錄號：GU014922）及其表達產(chǎn)物的生物信息分析
在所獲得的非重復序列中第11號基因與多種昆蟲胰島素類似的絲氨酸蛋白酶基因有較高的相似性，相似性得分的為123分的鱗翅目螟蛾科玉米螟胰島素類似的絲氨酸蛋白酶T22基因，其次為得分117分的鱗翅目夜蛾科棉鈴蟲胰蛋白酶基因，排名第三的為得分116分的小菜蛾類胰蛋白酶，NCBI網(wǎng)站對相似性較高的前6個基因的注釋相同：該基因表達產(chǎn)物為無活性的酶前體，經(jīng)過限制性蛋白水解酶加工后轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿?，參與代謝反應。根據(jù)比對結(jié)果及相關(guān)文獻（Zhu L，et al.2008；Spray F.J，et al.1991；Wu DD,et al.2009）推測該基因的表達產(chǎn)物參與酶聯(lián)激活反應，可能與小菜蛾的重要代謝、免疫反應及抗性形成相關(guān)。利用NCBI網(wǎng)站生物信息學數(shù)據(jù)對所得非重復序列中第11號基因表達蛋白的一級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果顯示，所得第11號基因包括開放閱讀框中的708個堿基，編碼236個氨基酸，分子量為24720，等電點6.89。SignalP網(wǎng)站在線預測信號肽結(jié)果顯示，序列的前17個氨基酸組成完整的信號肽，推測這與該基因參與酶聯(lián)激活反應有關(guān)，信號肽介導無活性的酶前體的運輸，酶前體經(jīng)過修飾后變成有活性的酶。
對第11號基因表達蛋白的二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域預測結(jié)果顯示，該基因表達蛋白的二級結(jié)構(gòu)包含4個α螺旋、11個β折疊、13個loop結(jié)構(gòu)。保守結(jié)構(gòu)域預測顯示第67位氨基酸和第116位氨基酸附近有兩個活性位點為保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與絲氨酸蛋白酶超家族的保守結(jié)構(gòu)域相似。推測該基因可能為絲氨酸蛋白酶超家族基因中的一個新成員。
3 討 論
自cDNA文庫問世以來，cDNA文庫就成為研究功能基因組學的基本方法之一，它能使我們高效、快速地獲得大規(guī)模的基因序列信息，而且其中的全長序列大大提高了測序和生物信息學預測的進程，也有利于以后的蛋白質(zhì)表達分析（Umezawa T,et al.2008）。相比以往的建庫方法，本實驗中采用ＸＬ１－Ｂｌｕｅ菌株制備超級感受態(tài)細胞，使得電轉(zhuǎn)化效率大大提高。考慮到小菜蛾生活史短，許多農(nóng)藥包括生物農(nóng)藥對于幼蟲3齡以后的害蟲防效較差（李高平等,2006），所以選取2齡幼蟲為建庫材料。測序是目前應用很廣泛的尋找新基因的手段，測序獲得的表達序列標簽（expressed sequence tags,ESTs）是來源于一定環(huán)境下一個組織的cDNA序列(Hao GP,et al.2009)。每一個EST序列代表一個表達基因的部分轉(zhuǎn)錄片段，通過對序列的分析可以獲得大量的基因表達信息。cDNA文庫建設(shè)只是發(fā)現(xiàn)基因和研究基因功能的基礎(chǔ)工作，文庫建成之后的分析預測以及基因功能深入研究才是目的。本實驗中對所建cDNA文庫測序得到了小菜蛾的部分EST序列，發(fā)現(xiàn)其中包括許多未知信息的新的EST序列。對其中部分序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)所測序列中的第11號基因的表達產(chǎn)物，不論從蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)或者結(jié)構(gòu)域推測，都與絲氨酸蛋白酶具有相似性，而絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的重要的蛋白水解酶,在生物有機體中起著重要而廣泛的生理作用 (Shi XZ,et al.2008;何智等,2004)，參與昆蟲體內(nèi)重要的代謝和免疫反應(Krem MM,et al.2001;王英,2006;程廷才,2008)，所以我們推測第11號基因是絲氨酸蛋白酶超家族基因中的一個新基因(GenBank登錄號：GU01492)，可能參與小菜蛾體內(nèi)重要的代謝或免疫反應，其具體的功能還有待于進一步深入研究。隨著文庫大規(guī)模測序的展開，必將有更多的新基因被發(fā)現(xiàn)。
關(guān)鍵詞：小菜蛾；全長cDNA文庫；EST序列；序列分析；絲氨酸蛋白酶
小菜蛾（Plutella xylostella）屬鱗翅目菜蛾科昆蟲，主要為害十字花科蔬菜，給農(nóng)業(yè)造成嚴重損失。小菜蛾繁殖力很強，每年發(fā)生數(shù)代甚至數(shù)十代，加之化學農(nóng)藥的大量施用，因此抗藥性發(fā)展特別快（羅雁婕等,2008）。而現(xiàn)有的生物農(nóng)藥對小菜蛾的防治效果也不是十分理想，尤其對于老熟幼蟲期以后的害蟲藥效差、擊倒速度慢等也是當前部分生物農(nóng)藥存在的問題（李高平等，2006）。未來殺蟲劑的開發(fā)研制越來越趨向于依靠分子生物學技術(shù)的發(fā)展創(chuàng)新，通過研究目標害蟲的功能基因從而找到適合的靶標，研制出針對性更強、效果更好的新型生物農(nóng)藥或?qū)Νh(huán)境友好、高效低毒的化學農(nóng)藥（鄭冬梅,2006；邱德文,2007）。而cDNA文庫是發(fā)現(xiàn)新基因和研究基因功能的基礎(chǔ)工具，本研究擬利用SMART技術(shù)，構(gòu)建小菜蛾2齡幼蟲全長cDNA文庫，為研究與小菜蛾抗性形成、免疫等相關(guān)的重要的功能基因打下基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 材料和試劑：
1.1.1 材料：小菜蛾成蟲捕捉于重慶地區(qū)蔬菜地，在實驗室條件下飼養(yǎng)兩代，取2齡幼蟲作為供試材料。
1.1.2 主要試劑：Creator SMART cDNA Library Construction Kit 購自Clontech公司，TRIZOL試劑、T4 DNA連接酶購自Invitrogen公司，mRNA純化試劑盒、核酸共沉劑、sfiⅠ限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒、凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司。
1.1.3 引物序列根據(jù)Creator SMART cDNA Library Construction Kit使用說明書，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成：建庫引物①SMART IV Oligonucleotide 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3'②CDS III/3' PCR Primer 5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3'③5' PCR Primer 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'；檢驗引物①M13 Forward Primer5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'②M13 Reverse Primer 5'-AAACAGCTATGACCATGTTCA-3'
1.2 方法
1.2.1 總RNA 和 mRNA提?。喊凑誘RIZOL試劑使用說明操作，將提取的總RNA用65℃、100μL DEPC水溶解，取適量RNA溶液進行瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計檢測總RNA的質(zhì)量。然后用mRNA提取試劑盒從總RNA中提取mRNA，在最終的mRNA提取液中加入4%（V/V）核酸共沉劑，置-20℃沉淀過夜。第二天冰凍離心回收mRNA沉淀，用10μL DEPC水溶解mRNA沉淀備用。
1.2.2 dscDNA的合成與分級分離：根據(jù)Creator SMART cDNA Library Construction Kit使用說明書操作，以mRNA為模板,在CDS Ⅲ/ 3pPCR 引物和SMART Ⅳ寡核苷酸引物的引導下,通過逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA，再以第一鏈cDNA為模板,加入CDS Ⅲ/ 3p PCR 引物和5p錨定引物,用LA-Taq酶經(jīng)過LD-PCR(long distance polymerase chain reaction)合成第二鏈cDNA。反應結(jié)束后取5μLPCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖電泳檢測。將雙鏈cDNA以PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后加入適量sfiⅠ酶切掉引物兩端的序列，酶切后的雙鏈cDNA經(jīng)過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，回收500bp以上的片段。
1.2.3 dscDNA與載體連接后電轉(zhuǎn)化：用T4 DNA連接酶將cDNA與試劑盒中提供的載體按照一定比例相連接。按照一般感受態(tài)細胞制備的方法制備大腸桿菌XL1-BLUE感受態(tài)細胞，驗證轉(zhuǎn)化效率后，將cDNA與載體連接后的產(chǎn)物經(jīng)過初步純化后與感受態(tài)細胞混合進行電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)過復蘇后鋪板，37℃生長12h。
1.2.4 文庫驗證和保存：進行文庫庫容量的計算，隨機挑取單菌落進行菌落PCR，驗證文庫重組率及插入片段大小。用含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基洗平板上的菌落，混勻后加甘油速凍保存于-80℃。
1.2.5 EST測序及分析：隨機挑取60個單克隆分別接種于加氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床250rpm培養(yǎng)10h后加甘油保存菌種，將甘油菌送到南京金思特生物技術(shù)公司進行正向測序，測序引物為T7引物。將測序得到的EST序列用Crossmatch軟件去除載體序列，用phrap軟件對序列進行聚類拼接，處理后用NCBI的BlastX和BlastN程序進行相似性比對，并對序列進行GO注釋。
1.2.6 基因分析：根據(jù)基因相似性比對結(jié)果用NCBI在線預測基因表達蛋白的一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域，用SinglP在線預測基因表達產(chǎn)物的信號肽。
2 結(jié)果與分析
2.1 總RNA及mRNA質(zhì)量
總RNA經(jīng)過凝膠電泳分析表明28S和18S條帶清晰無拖尾，兩者亮度之比約為2:1，說明所提RNA完好無降解，紫外分光光度計檢測OD260/OD280=1.80～2.0，可以用來進行文庫構(gòu)建。從總RNA中純化得到的mRNA經(jīng)過紫外分光光度計檢測，OD260/OD280=1.80～2.0。
2.2 dscDNA
首先對dscDNA擴增程序進行了優(yōu)化，比較LD-PCR過程中18-30個循環(huán)的dscDNA擴增效果，得出21個循環(huán)的擴增效果，如圖2所示，電泳檢測dscDNA彌散分布于0.2kb～4.5kb，表明該時期轉(zhuǎn)錄的mRNA復雜多樣，其中分布的數(shù)條明顯條帶代表高豐度表達基因。擴增產(chǎn)物經(jīng)紫外檢測OD260/OD280=1.7～1.9。
2.3 文庫質(zhì)量
對文庫隨機挑取的單菌落進行菌落PCR，如圖3所示，凝膠電泳檢測結(jié)果顯示外源片段大小主要分布在0.75～1.5kb，外源片段插入率為92% ,平均長度為1kb左右。對文庫涂板后菌落數(shù)量的計算得到原始庫容為1.1×106，擴增后的庫容達到2.6×109，達到文庫的質(zhì)量要求（王昆等，2005）。
2.4 文庫測序及序列比對
隨機挑取的60個克隆測序后得到55條高質(zhì)量的EST序列，對這55條EST序列進行聚類分析及拼接后,共獲得30個非重復序列(UniGene)。非重復序列的長度在400～1200bp之間，平均在800bp左右。對這30條序列使用NCBI中的BlastX程序進行本地搜索,結(jié)果顯示：16條序列與Genebank中已公布的序列有較高同源性，并且這些同源序列多為昆蟲的基因；14條序列沒有注解。BlastN程序搜索結(jié)果表明：10條序列與Genebank公布的序列有較高同源性，20條序列沒有注解。這些沒有注解的序列為該物種新的EST序列，序列登錄工作正在進行中。
對30條非重復序列進行GO注釋，結(jié)果顯示：其中有16條序列參與各種分子功能、細胞組成和生物過程，占EST序列總數(shù)的53%，其表達產(chǎn)物包括核糖體蛋白、金屬蛋白、酶類等在內(nèi)的10多種產(chǎn)物，主要為核糖體蛋白、孵化酶、延伸因子等。
2.5 第11號基因（GenBank登錄號：GU014922）及其表達產(chǎn)物的生物信息分析
在所獲得的非重復序列中第11號基因與多種昆蟲胰島素類似的絲氨酸蛋白酶基因有較高的相似性，相似性得分的為123分的鱗翅目螟蛾科玉米螟胰島素類似的絲氨酸蛋白酶T22基因，其次為得分117分的鱗翅目夜蛾科棉鈴蟲胰蛋白酶基因，排名第三的為得分116分的小菜蛾類胰蛋白酶，NCBI網(wǎng)站對相似性較高的前6個基因的注釋相同：該基因表達產(chǎn)物為無活性的酶前體，經(jīng)過限制性蛋白水解酶加工后轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿?，參與代謝反應。根據(jù)比對結(jié)果及相關(guān)文獻（Zhu L，et al.2008；Spray F.J，et al.1991；Wu DD,et al.2009）推測該基因的表達產(chǎn)物參與酶聯(lián)激活反應，可能與小菜蛾的重要代謝、免疫反應及抗性形成相關(guān)。利用NCBI網(wǎng)站生物信息學數(shù)據(jù)對所得非重復序列中第11號基因表達蛋白的一級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果顯示，所得第11號基因包括開放閱讀框中的708個堿基，編碼236個氨基酸，分子量為24720，等電點6.89。SignalP網(wǎng)站在線預測信號肽結(jié)果顯示，序列的前17個氨基酸組成完整的信號肽，推測這與該基因參與酶聯(lián)激活反應有關(guān)，信號肽介導無活性的酶前體的運輸，酶前體經(jīng)過修飾后變成有活性的酶。
對第11號基因表達蛋白的二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域預測結(jié)果顯示，該基因表達蛋白的二級結(jié)構(gòu)包含4個α螺旋、11個β折疊、13個loop結(jié)構(gòu)。保守結(jié)構(gòu)域預測顯示第67位氨基酸和第116位氨基酸附近有兩個活性位點為保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與絲氨酸蛋白酶超家族的保守結(jié)構(gòu)域相似。推測該基因可能為絲氨酸蛋白酶超家族基因中的一個新成員。
3 討 論
自cDNA文庫問世以來，cDNA文庫就成為研究功能基因組學的基本方法之一，它能使我們高效、快速地獲得大規(guī)模的基因序列信息，而且其中的全長序列大大提高了測序和生物信息學預測的進程，也有利于以后的蛋白質(zhì)表達分析（Umezawa T,et al.2008）。相比以往的建庫方法，本實驗中采用ＸＬ１－Ｂｌｕｅ菌株制備超級感受態(tài)細胞，使得電轉(zhuǎn)化效率大大提高。考慮到小菜蛾生活史短，許多農(nóng)藥包括生物農(nóng)藥對于幼蟲3齡以后的害蟲防效較差（李高平等,2006），所以選取2齡幼蟲為建庫材料。測序是目前應用很廣泛的尋找新基因的手段，測序獲得的表達序列標簽（expressed sequence tags,ESTs）是來源于一定環(huán)境下一個組織的cDNA序列(Hao GP,et al.2009)。每一個EST序列代表一個表達基因的部分轉(zhuǎn)錄片段，通過對序列的分析可以獲得大量的基因表達信息。cDNA文庫建設(shè)只是發(fā)現(xiàn)基因和研究基因功能的基礎(chǔ)工作，文庫建成之后的分析預測以及基因功能深入研究才是目的。本實驗中對所建cDNA文庫測序得到了小菜蛾的部分EST序列，發(fā)現(xiàn)其中包括許多未知信息的新的EST序列。對其中部分序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)所測序列中的第11號基因的表達產(chǎn)物，不論從蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)或者結(jié)構(gòu)域推測，都與絲氨酸蛋白酶具有相似性，而絲氨酸蛋白酶是一類以絲氨酸為活性中心的重要的蛋白水解酶,在生物有機體中起著重要而廣泛的生理作用 (Shi XZ,et al.2008;何智等,2004)，參與昆蟲體內(nèi)重要的代謝和免疫反應(Krem MM,et al.2001;王英,2006;程廷才,2008)，所以我們推測第11號基因是絲氨酸蛋白酶超家族基因中的一個新基因(GenBank登錄號：GU01492)，可能參與小菜蛾體內(nèi)重要的代謝或免疫反應，其具體的功能還有待于進一步深入研究。隨著文庫大規(guī)模測序的展開，必將有更多的新基因被發(fā)現(xiàn)。