【摘要】 目的 探討三七總皂苷、黃芪防治2型糖尿病動脈粥樣硬化的作用機制。方法 建立2型糖尿病大鼠模型，隨機分為糖尿病模型組及糖尿病三七總皂苷、黃芪治療組，并與正常對照組比較，分別測定各組大鼠血糖、血脂、氧化及糖化低密度脂蛋白水平，并取大鼠主動脈組織進行形態(tài)學(xué)觀察，計算病灶面積與管壁總面積比值。結(jié)果 2型糖尿病大鼠血糖、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、極低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）、氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）和糖化低密度脂蛋白（Gly-LDL）水平升高，高密度脂蛋白（HDL）下降，主動脈病變程度明顯。三七總皂苷、黃芪治療組動物各項指標(biāo)均有明顯改善。結(jié)論 三七總皂苷、黃芪可通過降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化發(fā)揮其防治2型糖尿病AS的作用。
【關(guān)鍵詞】 三七總皂苷；黃芪；氧化低密度脂蛋白；糖化低密度脂蛋白；動脈粥樣硬化；2型糖尿病
大血管病變是2型糖尿?。―M）的常見并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅著人類的健康，其突出的病理變化是動脈粥樣硬化（AS）。近年研究表明，修飾型低密度脂蛋白主要包括氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）和糖化低密度脂蛋白（Gly-LDL）等，在AS的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用。本研究通過高脂膳食喂養(yǎng)SD大鼠，再注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘發(fā)胰島素抵抗和高血糖，從而建立2型糖尿病大鼠模型。在此基礎(chǔ)上通過測定大鼠血中修飾型低密度脂蛋白水平探討其與糖尿病AS的關(guān)系。給予糖尿病大鼠三七總皂苷、黃芪干預(yù)治療，探討兩藥對糖尿病AS的防治作用及作用機制。
1 材料與方法
1.1 動物 選用雌性SD大鼠，二級動物（購自河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心），共40只，體重180～200g，于清潔動物室飼養(yǎng)。
1.2 主要藥品試劑 鏈脲佐菌素（STZ）為美國Sigma公司產(chǎn)品；膽固醇購自河南省益康生化原料廠；膽酸購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；Ox-LDL酶聯(lián)免疫試劑盒購自上海榮盛生物技術(shù)公司；三七總皂苷（血塞通），云南植物藥業(yè)有限公司，含三七總皂苷250mg/10ml，批號20020405，黃芪（黃芪注射液），成都地奧九泓制藥廠，相當(dāng)于原藥材20g/10ml，批號0301043。
1.3 主要儀器 全自動生化分析儀：Olympus AU2700；酶標(biāo)儀：奧地利Anthos公司 HT-2；分光光度計:722型光柵分光光度計（上海第三儀器廠）；切片漂烘溫控儀：安徽電子科學(xué)研究所QP-B型；輪轉(zhuǎn)切片機：德國萊卡RM-2135；數(shù)顯電熱恒溫干燥箱：上海陽光實驗儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡：日本Olympus CH20。
1.4 方法
1.4.1 動物模型的建立 雌性SD大鼠40只，先隨機選10只為正常對照組（A組），其余30只用于制備2型糖尿病動物模型。造模組動物高脂飼料喂養(yǎng)1個月，然后腹腔注射30mg/kg STZ。2周后，選取血糖持續(xù)2天＞11.1mmol/L為糖尿病動物模型。將糖尿病大鼠隨機分為兩組即糖尿病模型組（B組）10只，糖尿病三七總皂苷、黃芪治療組（C組）12只。
1.4.2 藥物干預(yù)治療 共12周。A組：實驗過程中喂常規(guī)飼料，每日自來水灌胃。B組：實驗過程中喂高脂飼料，每日自來水灌胃。C組：實驗過程中喂高脂飼料，每日三七總皂苷（血塞通）灌胃（100mg/kg）及黃芪注射液灌胃（8g/kg）。
1.4.3 標(biāo)本采集及觀察指標(biāo) 實驗18周末股動脈放血處死動物，留取血標(biāo)本，-20℃保存，待用于測定FBG、TG、TC、極低密度脂蛋白（VLDL）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL），應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附方法測定Ox-LDL，低濃度氯化硝基四氮唑藍還原法測定Gly-LDL。然后迅速打開胸腔，分離主動脈，剔除表面脂肪組織，于主動脈根部切取約2cm主動脈置于10%多聚甲醛中固定，待光鏡檢測。
1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 所有統(tǒng)計過程均由SPSS11.0統(tǒng)計軟件完成，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用方差分析，相關(guān)分析采用直線相關(guān)。
2 結(jié)果
2.1 各組大鼠血脂變化。B組大鼠血清TG、TC、VLDL、LDL均較A組明顯升高(均P<0.01)，C組較B組明顯下降(分別為P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.05)，B組大鼠血清HDL較A組顯著降低(P<0.01)，C組高于B組(P<0.01)。注：1)P<0.05,2)P<0.01 vs group A；3)P<0.05,4)P<0.01 vs group B
2.2 各組大鼠血糖及修飾型低密度脂蛋白水平變化。B組大鼠血糖較A組明顯升高(P<0.01)，C組較B組明顯降低(P<0.01)。B組大鼠Ox-LDL、Gly-LDL水平顯著高于A組(P<0.01)，C組較B組明顯下降(P<0.01)。相關(guān)分析表明糖尿病大鼠Ox-LDL水平與血糖、LDL水平呈正相關(guān)（分別r=0.548，P<0.05；r=0.697，P<0.01），與HDL水平呈負(fù)相關(guān)（r=－0.685，P<0.01）。Gly-LDL水平與Ox-LDL、血糖呈正相關(guān)（分別r=0.744，P<0.01；r=0.715，P<0.01）。注：1)P<0.05,2)P<0.01 vs group A；3)P<0.05,4)P<0.01 vs group B
2.3 組織形態(tài)學(xué)改變 。正常對照組大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞扁平，內(nèi)膜平坦，中膜平滑肌細(xì)胞（SMC）與彈力板近似平行相間排列。糖尿病模型組大鼠主動脈橫斷面上可見較多的內(nèi)膜增厚病灶，其內(nèi)主要由排列紊亂的增生SMC組成，病灶表面內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，內(nèi)彈力板厚薄不均，有斷裂分離現(xiàn)象，中膜淺層SMC輕度增生、排列紊亂。治療組的動脈粥樣硬化病變明顯輕于模型組，僅見較少的病灶。各組主動脈橫斷面病灶總面積與管壁總面積比值分別為：A組(0.57±0.20)%；B組(1.90±0.34)%；C組(0.75±0.25)%。B組較A組病變程度明顯加重(P<0.01)，C組較B組病變程度明顯減輕(P<0.01)。相關(guān)分析表明主動脈病變程度與Ox-LDL、Gly-LDL水平呈正相關(guān)（分別r=0.650，P<0.01；r=0.632，P<0.01）。注：1)P<0.05,2)P<0.01 vs group A；3)P<0.05,4)P<0.01 vs group B
3 討論
動脈粥樣硬化是糖尿病大血管病變的主要病理表現(xiàn)，與非糖尿病患者相比糖尿病患者AS具有發(fā)病早、進展快、病情重、預(yù)后差的特點。低密度脂蛋白（LDL）與AS有著非常密切的關(guān)系，但由于反饋調(diào)節(jié)作用，巨噬細(xì)胞與天然LDL共同孵育不能轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。修飾型LDL的發(fā)現(xiàn)為闡明LDL的致AS作用提供了有力依據(jù)。
Ox-LDL是一種重要的致AS因子，它首先于20世紀(jì)80年代末被發(fā)現(xiàn)。Paul等證實Ox-LDL是AS病變的早期標(biāo)志物，血漿Ox-LDL水平升高的受試者約94%存在心血管疾病。有研究表明，糖尿病患者的LDL更容易被氧化成Ox-LDL。近期研究證實2型糖尿病患者體內(nèi)Ox-LDL與LDL比值的升高與糖尿病大血管病的發(fā)病密切相關(guān)。本研究中，糖尿病大鼠血漿中Ox-LDL水平明顯高于正常對照組，并且同時存在血糖升高和血脂紊亂。相關(guān)分析表明Ox-LDL水平與血糖及LDL水平呈正相關(guān)，與HDL呈負(fù)相關(guān)，提示血糖升高及血脂紊亂均是造成Ox-LDL升高的原因，機制可能為DM病人血糖升高導(dǎo)致自由基產(chǎn)生增多，抗氧化物質(zhì)活性及作用降低；同時從DM病人體內(nèi)分離出的LDL分子體積明顯小于正常對照組的體積，且含有的還原性VitE也減少，小而密的LDL更易于被氧化。
本研究還發(fā)現(xiàn)Ox-LDL水平與大鼠主動脈AS病變面積呈正相關(guān)，也說明在糖尿病動脈粥樣硬化病變的發(fā)生中，Ox-LDL是一個重要致病因素，并且Ox-LDL水平可反映病變的嚴(yán)重程度。Gly-LDL是LDL經(jīng)過糖化修飾的產(chǎn)物。早在20世紀(jì)80年代初就有學(xué)者推測DM病人體內(nèi)的LDL可能會受到非酶糖化的影響，從而在體內(nèi)產(chǎn)生Gly-LDL，對DM病人AS的形成起作用。研究表明Gly-LDL與血管基質(zhì)蛋白結(jié)合，使基底膜增厚，血管壁彈性降低。另外，Gly-LDL具有的細(xì)胞毒作用和對細(xì)胞因子的影響如使巨噬細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子等釋放增加都加速動脈硬化的形成。本研究結(jié)果顯示糖尿病大鼠血清中Gly-LDL水平明顯升高，其水平與血糖、Ox-LDL水平及AS損傷面積呈正相關(guān)。結(jié)果提示LDL糖基化可能是糖脂代謝障礙相互影響的中間環(huán)節(jié)，在糖尿病AS的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用；血糖升高是糖尿病并發(fā)AS的重要原因，揭示了控制高血糖的重要性；兩種修飾型LDL既可以獨立發(fā)揮作用又可相互促進，進一步加速AS進展。氧化作用參與了蛋白質(zhì)的非酶糖化，后者開始于還原糖的自身氧化，糖化氧化和自身氧化兩種途徑在非酶糖化中均可發(fā)生，只是在某種條件下以某一途徑為主。
中醫(yī)認(rèn)為糖尿病患者無論是并發(fā)大血管病變還是微血管病變，都與血瘀證密切相關(guān)。中藥防治糖尿病已有數(shù)千年歷史，三七總皂苷和黃芪均為常用藥物。中醫(yī)認(rèn)為三七總皂苷具有活血化瘀的功效而黃芪具有益氣的作用。黃芪多糖可以降低2型糖尿病胰島素抵抗大鼠血糖和改善體內(nèi)脂代謝紊亂。同時黃芪能抑制非酶糖基化產(chǎn)物生成和氧化應(yīng)激反應(yīng)。三七皂苷(PNS)為三七的主要有效活性成分,對多種心血管疾病具有良好的療效,通常認(rèn)為其機制與降血脂、 調(diào)血栓、擴張血管、抗氧化等藥理作用有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示三七總皂苷和黃芪聯(lián)合治療組動物各項檢測指標(biāo)及形態(tài)學(xué)改變均較糖尿病模型組有明顯改善，三七總皂苷和黃芪資源豐富，價格低廉，毒副作用小。進一步觀察兩者的臨床療效，應(yīng)用現(xiàn)代分子生化技術(shù)探討其作用機制，對開展中西醫(yī)結(jié)合治療糖尿病及糖尿病AS有重要意義。
【關(guān)鍵詞】 三七總皂苷；黃芪；氧化低密度脂蛋白；糖化低密度脂蛋白；動脈粥樣硬化；2型糖尿病
大血管病變是2型糖尿?。―M）的常見并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅著人類的健康，其突出的病理變化是動脈粥樣硬化（AS）。近年研究表明，修飾型低密度脂蛋白主要包括氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）和糖化低密度脂蛋白（Gly-LDL）等，在AS的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用。本研究通過高脂膳食喂養(yǎng)SD大鼠，再注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘發(fā)胰島素抵抗和高血糖，從而建立2型糖尿病大鼠模型。在此基礎(chǔ)上通過測定大鼠血中修飾型低密度脂蛋白水平探討其與糖尿病AS的關(guān)系。給予糖尿病大鼠三七總皂苷、黃芪干預(yù)治療，探討兩藥對糖尿病AS的防治作用及作用機制。
1 材料與方法
1.1 動物 選用雌性SD大鼠，二級動物（購自河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心），共40只，體重180～200g，于清潔動物室飼養(yǎng)。
1.2 主要藥品試劑 鏈脲佐菌素（STZ）為美國Sigma公司產(chǎn)品；膽固醇購自河南省益康生化原料廠；膽酸購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；Ox-LDL酶聯(lián)免疫試劑盒購自上海榮盛生物技術(shù)公司；三七總皂苷（血塞通），云南植物藥業(yè)有限公司，含三七總皂苷250mg/10ml，批號20020405，黃芪（黃芪注射液），成都地奧九泓制藥廠，相當(dāng)于原藥材20g/10ml，批號0301043。
1.3 主要儀器 全自動生化分析儀：Olympus AU2700；酶標(biāo)儀：奧地利Anthos公司 HT-2；分光光度計:722型光柵分光光度計（上海第三儀器廠）；切片漂烘溫控儀：安徽電子科學(xué)研究所QP-B型；輪轉(zhuǎn)切片機：德國萊卡RM-2135；數(shù)顯電熱恒溫干燥箱：上海陽光實驗儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡：日本Olympus CH20。
1.4 方法
1.4.1 動物模型的建立 雌性SD大鼠40只，先隨機選10只為正常對照組（A組），其余30只用于制備2型糖尿病動物模型。造模組動物高脂飼料喂養(yǎng)1個月，然后腹腔注射30mg/kg STZ。2周后，選取血糖持續(xù)2天＞11.1mmol/L為糖尿病動物模型。將糖尿病大鼠隨機分為兩組即糖尿病模型組（B組）10只，糖尿病三七總皂苷、黃芪治療組（C組）12只。
1.4.2 藥物干預(yù)治療 共12周。A組：實驗過程中喂常規(guī)飼料，每日自來水灌胃。B組：實驗過程中喂高脂飼料，每日自來水灌胃。C組：實驗過程中喂高脂飼料，每日三七總皂苷（血塞通）灌胃（100mg/kg）及黃芪注射液灌胃（8g/kg）。
1.4.3 標(biāo)本采集及觀察指標(biāo) 實驗18周末股動脈放血處死動物，留取血標(biāo)本，-20℃保存，待用于測定FBG、TG、TC、極低密度脂蛋白（VLDL）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL），應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附方法測定Ox-LDL，低濃度氯化硝基四氮唑藍還原法測定Gly-LDL。然后迅速打開胸腔，分離主動脈，剔除表面脂肪組織，于主動脈根部切取約2cm主動脈置于10%多聚甲醛中固定，待光鏡檢測。
1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 所有統(tǒng)計過程均由SPSS11.0統(tǒng)計軟件完成，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用方差分析，相關(guān)分析采用直線相關(guān)。
2 結(jié)果
2.1 各組大鼠血脂變化。B組大鼠血清TG、TC、VLDL、LDL均較A組明顯升高(均P<0.01)，C組較B組明顯下降(分別為P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.05)，B組大鼠血清HDL較A組顯著降低(P<0.01)，C組高于B組(P<0.01)。注：1)P<0.05,2)P<0.01 vs group A；3)P<0.05,4)P<0.01 vs group B
2.2 各組大鼠血糖及修飾型低密度脂蛋白水平變化。B組大鼠血糖較A組明顯升高(P<0.01)，C組較B組明顯降低(P<0.01)。B組大鼠Ox-LDL、Gly-LDL水平顯著高于A組(P<0.01)，C組較B組明顯下降(P<0.01)。相關(guān)分析表明糖尿病大鼠Ox-LDL水平與血糖、LDL水平呈正相關(guān)（分別r=0.548，P<0.05；r=0.697，P<0.01），與HDL水平呈負(fù)相關(guān)（r=－0.685，P<0.01）。Gly-LDL水平與Ox-LDL、血糖呈正相關(guān)（分別r=0.744，P<0.01；r=0.715，P<0.01）。注：1)P<0.05,2)P<0.01 vs group A；3)P<0.05,4)P<0.01 vs group B
2.3 組織形態(tài)學(xué)改變 。正常對照組大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞扁平，內(nèi)膜平坦，中膜平滑肌細(xì)胞（SMC）與彈力板近似平行相間排列。糖尿病模型組大鼠主動脈橫斷面上可見較多的內(nèi)膜增厚病灶，其內(nèi)主要由排列紊亂的增生SMC組成，病灶表面內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，內(nèi)彈力板厚薄不均，有斷裂分離現(xiàn)象，中膜淺層SMC輕度增生、排列紊亂。治療組的動脈粥樣硬化病變明顯輕于模型組，僅見較少的病灶。各組主動脈橫斷面病灶總面積與管壁總面積比值分別為：A組(0.57±0.20)%；B組(1.90±0.34)%；C組(0.75±0.25)%。B組較A組病變程度明顯加重(P<0.01)，C組較B組病變程度明顯減輕(P<0.01)。相關(guān)分析表明主動脈病變程度與Ox-LDL、Gly-LDL水平呈正相關(guān)（分別r=0.650，P<0.01；r=0.632，P<0.01）。注：1)P<0.05,2)P<0.01 vs group A；3)P<0.05,4)P<0.01 vs group B
3 討論
動脈粥樣硬化是糖尿病大血管病變的主要病理表現(xiàn)，與非糖尿病患者相比糖尿病患者AS具有發(fā)病早、進展快、病情重、預(yù)后差的特點。低密度脂蛋白（LDL）與AS有著非常密切的關(guān)系，但由于反饋調(diào)節(jié)作用，巨噬細(xì)胞與天然LDL共同孵育不能轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。修飾型LDL的發(fā)現(xiàn)為闡明LDL的致AS作用提供了有力依據(jù)。
Ox-LDL是一種重要的致AS因子，它首先于20世紀(jì)80年代末被發(fā)現(xiàn)。Paul等證實Ox-LDL是AS病變的早期標(biāo)志物，血漿Ox-LDL水平升高的受試者約94%存在心血管疾病。有研究表明，糖尿病患者的LDL更容易被氧化成Ox-LDL。近期研究證實2型糖尿病患者體內(nèi)Ox-LDL與LDL比值的升高與糖尿病大血管病的發(fā)病密切相關(guān)。本研究中，糖尿病大鼠血漿中Ox-LDL水平明顯高于正常對照組，并且同時存在血糖升高和血脂紊亂。相關(guān)分析表明Ox-LDL水平與血糖及LDL水平呈正相關(guān)，與HDL呈負(fù)相關(guān)，提示血糖升高及血脂紊亂均是造成Ox-LDL升高的原因，機制可能為DM病人血糖升高導(dǎo)致自由基產(chǎn)生增多，抗氧化物質(zhì)活性及作用降低；同時從DM病人體內(nèi)分離出的LDL分子體積明顯小于正常對照組的體積，且含有的還原性VitE也減少，小而密的LDL更易于被氧化。
本研究還發(fā)現(xiàn)Ox-LDL水平與大鼠主動脈AS病變面積呈正相關(guān)，也說明在糖尿病動脈粥樣硬化病變的發(fā)生中，Ox-LDL是一個重要致病因素，并且Ox-LDL水平可反映病變的嚴(yán)重程度。Gly-LDL是LDL經(jīng)過糖化修飾的產(chǎn)物。早在20世紀(jì)80年代初就有學(xué)者推測DM病人體內(nèi)的LDL可能會受到非酶糖化的影響，從而在體內(nèi)產(chǎn)生Gly-LDL，對DM病人AS的形成起作用。研究表明Gly-LDL與血管基質(zhì)蛋白結(jié)合，使基底膜增厚，血管壁彈性降低。另外，Gly-LDL具有的細(xì)胞毒作用和對細(xì)胞因子的影響如使巨噬細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子等釋放增加都加速動脈硬化的形成。本研究結(jié)果顯示糖尿病大鼠血清中Gly-LDL水平明顯升高，其水平與血糖、Ox-LDL水平及AS損傷面積呈正相關(guān)。結(jié)果提示LDL糖基化可能是糖脂代謝障礙相互影響的中間環(huán)節(jié)，在糖尿病AS的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用；血糖升高是糖尿病并發(fā)AS的重要原因，揭示了控制高血糖的重要性；兩種修飾型LDL既可以獨立發(fā)揮作用又可相互促進，進一步加速AS進展。氧化作用參與了蛋白質(zhì)的非酶糖化，后者開始于還原糖的自身氧化，糖化氧化和自身氧化兩種途徑在非酶糖化中均可發(fā)生，只是在某種條件下以某一途徑為主。
中醫(yī)認(rèn)為糖尿病患者無論是并發(fā)大血管病變還是微血管病變，都與血瘀證密切相關(guān)。中藥防治糖尿病已有數(shù)千年歷史，三七總皂苷和黃芪均為常用藥物。中醫(yī)認(rèn)為三七總皂苷具有活血化瘀的功效而黃芪具有益氣的作用。黃芪多糖可以降低2型糖尿病胰島素抵抗大鼠血糖和改善體內(nèi)脂代謝紊亂。同時黃芪能抑制非酶糖基化產(chǎn)物生成和氧化應(yīng)激反應(yīng)。三七皂苷(PNS)為三七的主要有效活性成分,對多種心血管疾病具有良好的療效,通常認(rèn)為其機制與降血脂、 調(diào)血栓、擴張血管、抗氧化等藥理作用有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示三七總皂苷和黃芪聯(lián)合治療組動物各項檢測指標(biāo)及形態(tài)學(xué)改變均較糖尿病模型組有明顯改善，三七總皂苷和黃芪資源豐富，價格低廉，毒副作用小。進一步觀察兩者的臨床療效，應(yīng)用現(xiàn)代分子生化技術(shù)探討其作用機制，對開展中西醫(yī)結(jié)合治療糖尿病及糖尿病AS有重要意義。