【關(guān)鍵詞】 膽紅
【摘要】 目的 為了解決膽紅素試劑的穩(wěn)定性，盡量排除基質(zhì)效應(yīng)對測定的影響，本科室采用了雙試劑方法測定。方法 對雙試劑測定作了重復(fù)、線性、回收試驗分別對單、雙試劑作了對比、試劑開瓶試驗。結(jié)果 改良J-G法（Y）與雙試劑法（X）相關(guān)性良好，相關(guān)方程為:Y TB =0.999X TB -0.482（r=0.998）Y DB =1.011X DB +1.612（r=0.999）總膽紅素批內(nèi)、批間高低平均變異系數(shù)分別為:1.34%、1.37%3.22%、3.34%，平均回收率達98.8%，在0～470μmol/L范圍內(nèi)線性良好。直接膽紅素批內(nèi)、批間高低平均變異系數(shù)分別為:1.42%、1.50%3.51%、3.62%，平均回收率達98.1%，在0～410μmol/L范圍內(nèi)線性良好。溶血、脂血樣品TB 1 、DB 1 明顯高于TB 2 、DB 2 ，無黃疸標(biāo)本DB 1 也明顯高于DB 2 ，黃疸標(biāo)本兩法間差異無顯著性，雙試劑工作液在2℃～30℃放置60天均穩(wěn)定，單試劑在配制后2℃～30℃7天后試劑變黃結(jié)果明顯偏低。結(jié)論 雙試劑能提高試劑的穩(wěn)定性，排除基質(zhì)效應(yīng)，更適合全自動分析測定。
關(guān)鍵詞 膽紅素 雙試劑 全自動分析
為了解決膽紅素試劑的穩(wěn)定性，盡量排除基質(zhì)效應(yīng)對測定的影響，本科采用了雙試劑方法測定。現(xiàn)報告如下。
1 材料與方法
1.1 試劑組成 Trace試劑?？偰懠t素試劑A:鹽酸0.1mol/L，對氨基苯磺酶0.050mol/L，表面活性劑1%試劑B:亞硝酸0.072mol/L直接膽紅素試劑A:鹽酸0.165mol/L，對氨基苯磺酶0.029mol/L試劑B:亞硝酸0.072mol/L。
1.2 試劑配制
1.2.1 TBil單試劑法（TB 1 ） 試劑A:試劑B=50:1，使用前混合。
1.2.2 TBil雙試劑法（TB 2 ） 第一試劑R 1 為A第二試劑R 2 為試劑B與雙蒸水50:1配制使用。
1.2.3 DBil單試劑法（DB 1 ） 試劑A:試劑B=100:1，使用前混合。
1.2.4 DBil雙試劑（DB 2 ） 第一試劑R 1 為A:第二試劑R 2 為試劑B與雙蒸水100:1配制使用。
1.3 儀器 美國康寧560生化分析儀。
1.4 測定主要參數(shù) 見表1。
2 結(jié)果
2.1 方法比較 本方法與改良J-G法比較，改良J-G法（見全國臨床檢驗操作規(guī)程第二版）為手工操作，設(shè)為Y，n=40，TB濃度2.76～456.3μmol/L，Y TB =0.995X TB +1.680，r=0.999，DB濃度0.89～402.8μmol/L，Y DB =1.011X DB +1.612，r=0.9984。
2.2 重復(fù)性試驗 總膽紅素批內(nèi)n=10，ˉx 低 =34.3±0.46，CV%=1.34%ˉx 高 =376.7±2.54，CV%=1.37%直接膽紅素批內(nèi)n=10，ˉx 低 =11.9±0.14，CV%=1.42%，ˉx 高 =169.3±2.54，CV%=1.50%總膽紅素批間n=10（天），ˉx 低 =34.8±1.12，CV%=3.22%ˉx 高=376.7±5.12，CV%=3.34%，直接膽紅素批間n=10（天），ˉx 低 =22.5±0.79，CV%=3.51%ˉx 高 =167.9±5.23，CV%=3.62%。
2.3 回收試驗 取已知定值血清加入一定量標(biāo)準(zhǔn)品，測定其回收率，總膽紅素回收率96.8%～102.7%，平均為99.5%直接膽紅素回收率為96.6%～103.2%，平均為98.8%。
2.4 線性試驗 按NCCLS線性評價方法 ［1］ ，取TB、DB含量分別為:高值470μmol/L、410μmol/L低值6.7μmol/L、3.6μmol/L的血清高低值等量混合得中值，中值血清與高低值血清等量混合得五種不同濃度的樣品，對其進行測定，測得值（Y）與理論值（X）作統(tǒng)計學(xué)處理，回歸方程Y TB =0.9973X TB -0.4965，r=0.9993Y DB =1.016X DB +1.278，結(jié)果表明TB、DB分別在0～470μmol/L、0～410μmol/L范圍內(nèi)測定線性良好。
2.5 單雙試劑對比試驗 按NCCLS評價方法 ［2］ ，取50例TB、DB含量不同的血清標(biāo)本（TB0.97～462.3μmol/L，DB0.54～398.2μmol/L），以本法（Y）和改良J-G（X）法同時測定，對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理，回歸方程分別Y TB =1.001X TB +0.489（r=0.999）配對t檢驗，t=1.28<1.96，P>0.05兩法測定差異無顯著性，Y DB =0.987X DB +1.8751r=0.998配對t檢驗，t=1.53<1.96，P>0.05兩法測定差異無顯著性說明TB、DB雙試劑測定方法與J-G測定方法一致性良好。
2.6 單、雙試劑測定膽紅素的比較 按NCCLS干擾試驗評價方法 ［2］ 在常規(guī)標(biāo)本中選擇正常血清120例，溶血標(biāo)本40例:Hb1.0～6.0g/L，脂血標(biāo)本（脂濁度在±～3+）TG為1.89～12.7mmol/L黃疸標(biāo)本50例（TB26.9～469.1μmol/L， DB11.6～387.5μmol/L）同時用兩種方法測定，結(jié)果見表2，由表2顯示:溶血、脂血樣品TB 1 、DB 1 明顯高于TB 2 、DB 2 ，無黃疸標(biāo)本DB 1 也明顯高于DB 2 ，黃疸標(biāo)本兩法間差異無顯著性，結(jié)果與文獻 ［3］ 基本一致。
2.7 試劑開瓶試驗 由表3顯示，工作試劑單試劑在7天后使膽紅素測定結(jié)果明顯偏低，雙試劑的工作試劑在60天內(nèi)無明顯變化，（注: ˇ 試劑配制后測定時間均在室溫狀態(tài)下操作，工作完成后再把工作試劑放回2℃～4℃冰箱）。
3 討論
雙試劑方法精密度良好，線性比單試劑明顯提高，雙試劑總膽紅素、直接膽紅素工作液增多為液體雙試劑，經(jīng)試驗證明:雙試劑工作液由于各工作液沒單獨的化學(xué)反應(yīng)，試劑在2℃～4℃，室溫均能穩(wěn)定保存，無需臨時配制工作液，既方便了工作，又提高了工作效率，由于雙蒸水的加入最終使工作液的pH值發(fā)生了變化，緩沖液pH值對完成反應(yīng)及反應(yīng)速度有明顯的變化，隨著pH值的增高，反應(yīng)速度加快，靈敏度增高 ［4］ ，樣品空白、雙波長參數(shù)的設(shè)置可以消除背景的吸收，減少樣品的顏色和濁度所產(chǎn)生的影響，雙波長對電源波動還有些補償效果。（可能這也是雙試劑測定方法線性提高的主要原因，有待探討。）由試驗結(jié)果表明溶血和脂血標(biāo)本嚴(yán)重干擾單試TB 1 、DB 1 法，使血清膽紅素假性增高，這主要歸結(jié)于儀器參數(shù)的選擇問題，單試劑法無法設(shè)置樣品空白，而雙試劑法能夠有樣品空白，這樣就能有效地扣除共存基質(zhì)的干擾，盡可能地排除誤判、錯判正常血清TB測定單、雙試劑變化不明顯 DB單試劑法常高于6μmol/L，黃疸標(biāo)本（無溶血，無脂血）兩法有可比性。雙試劑法（扣除樣品空白的二點終點法）經(jīng)試驗及1年多的臨床證實，確為一種方便、準(zhǔn)確測定血清膽紅素的常規(guī)方法，適用于具有參數(shù)設(shè)置為:雙試劑、樣品空白，雙波長功能的生化分析儀使用。
表1 康寧560主要參數(shù)
注:ˇλ1為主波長，λ2為副波長，雙試劑第一時間點為樣品空白讀數(shù)
表2 單、雙試劑測定膽紅素的比較
注:類標(biāo)本相同項目的方法間比較 ˇˇ P<0.001， ˇ P<0.05
表3 單雙試劑開瓶試驗觀察時間
注:“/”表示沒再測定
參考文獻
1 楊國昌，許葉，張抗.精密度評價和方法比較中NCCLS評價方案的應(yīng)用.臨床檢驗雜志，1999，17（1）:47-49.
2 楊國昌，許葉，張抗.線性評價和干擾試驗中NCCLS價方案的應(yīng)用.臨床檢驗雜志，1999，17（3）:184-186.
3 黃維嘉，陽萍，陳宏礎(chǔ).雙試劑自動分析法測定血清膽紅素.臨床檢驗雜志，1998，17（1）:30-31.
4 邱谷.高碘酸鈉氧化法測定血清總膽紅素.臨床檢驗雜志，2000，18（6）:345-346.
【摘要】 目的 為了解決膽紅素試劑的穩(wěn)定性，盡量排除基質(zhì)效應(yīng)對測定的影響，本科室采用了雙試劑方法測定。方法 對雙試劑測定作了重復(fù)、線性、回收試驗分別對單、雙試劑作了對比、試劑開瓶試驗。結(jié)果 改良J-G法（Y）與雙試劑法（X）相關(guān)性良好，相關(guān)方程為:Y TB =0.999X TB -0.482（r=0.998）Y DB =1.011X DB +1.612（r=0.999）總膽紅素批內(nèi)、批間高低平均變異系數(shù)分別為:1.34%、1.37%3.22%、3.34%，平均回收率達98.8%，在0～470μmol/L范圍內(nèi)線性良好。直接膽紅素批內(nèi)、批間高低平均變異系數(shù)分別為:1.42%、1.50%3.51%、3.62%，平均回收率達98.1%，在0～410μmol/L范圍內(nèi)線性良好。溶血、脂血樣品TB 1 、DB 1 明顯高于TB 2 、DB 2 ，無黃疸標(biāo)本DB 1 也明顯高于DB 2 ，黃疸標(biāo)本兩法間差異無顯著性，雙試劑工作液在2℃～30℃放置60天均穩(wěn)定，單試劑在配制后2℃～30℃7天后試劑變黃結(jié)果明顯偏低。結(jié)論 雙試劑能提高試劑的穩(wěn)定性，排除基質(zhì)效應(yīng)，更適合全自動分析測定。
關(guān)鍵詞 膽紅素 雙試劑 全自動分析
為了解決膽紅素試劑的穩(wěn)定性，盡量排除基質(zhì)效應(yīng)對測定的影響，本科采用了雙試劑方法測定。現(xiàn)報告如下。
1 材料與方法
1.1 試劑組成 Trace試劑?？偰懠t素試劑A:鹽酸0.1mol/L，對氨基苯磺酶0.050mol/L，表面活性劑1%試劑B:亞硝酸0.072mol/L直接膽紅素試劑A:鹽酸0.165mol/L，對氨基苯磺酶0.029mol/L試劑B:亞硝酸0.072mol/L。
1.2 試劑配制
1.2.1 TBil單試劑法（TB 1 ） 試劑A:試劑B=50:1，使用前混合。
1.2.2 TBil雙試劑法（TB 2 ） 第一試劑R 1 為A第二試劑R 2 為試劑B與雙蒸水50:1配制使用。
1.2.3 DBil單試劑法（DB 1 ） 試劑A:試劑B=100:1，使用前混合。
1.2.4 DBil雙試劑（DB 2 ） 第一試劑R 1 為A:第二試劑R 2 為試劑B與雙蒸水100:1配制使用。
1.3 儀器 美國康寧560生化分析儀。
1.4 測定主要參數(shù) 見表1。
2 結(jié)果
2.1 方法比較 本方法與改良J-G法比較，改良J-G法（見全國臨床檢驗操作規(guī)程第二版）為手工操作，設(shè)為Y，n=40，TB濃度2.76～456.3μmol/L，Y TB =0.995X TB +1.680，r=0.999，DB濃度0.89～402.8μmol/L，Y DB =1.011X DB +1.612，r=0.9984。
2.2 重復(fù)性試驗 總膽紅素批內(nèi)n=10，ˉx 低 =34.3±0.46，CV%=1.34%ˉx 高 =376.7±2.54，CV%=1.37%直接膽紅素批內(nèi)n=10，ˉx 低 =11.9±0.14，CV%=1.42%，ˉx 高 =169.3±2.54，CV%=1.50%總膽紅素批間n=10（天），ˉx 低 =34.8±1.12，CV%=3.22%ˉx 高=376.7±5.12，CV%=3.34%，直接膽紅素批間n=10（天），ˉx 低 =22.5±0.79，CV%=3.51%ˉx 高 =167.9±5.23，CV%=3.62%。
2.3 回收試驗 取已知定值血清加入一定量標(biāo)準(zhǔn)品，測定其回收率，總膽紅素回收率96.8%～102.7%，平均為99.5%直接膽紅素回收率為96.6%～103.2%，平均為98.8%。
2.4 線性試驗 按NCCLS線性評價方法 ［1］ ，取TB、DB含量分別為:高值470μmol/L、410μmol/L低值6.7μmol/L、3.6μmol/L的血清高低值等量混合得中值，中值血清與高低值血清等量混合得五種不同濃度的樣品，對其進行測定，測得值（Y）與理論值（X）作統(tǒng)計學(xué)處理，回歸方程Y TB =0.9973X TB -0.4965，r=0.9993Y DB =1.016X DB +1.278，結(jié)果表明TB、DB分別在0～470μmol/L、0～410μmol/L范圍內(nèi)測定線性良好。
2.5 單雙試劑對比試驗 按NCCLS評價方法 ［2］ ，取50例TB、DB含量不同的血清標(biāo)本（TB0.97～462.3μmol/L，DB0.54～398.2μmol/L），以本法（Y）和改良J-G（X）法同時測定，對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理，回歸方程分別Y TB =1.001X TB +0.489（r=0.999）配對t檢驗，t=1.28<1.96，P>0.05兩法測定差異無顯著性，Y DB =0.987X DB +1.8751r=0.998配對t檢驗，t=1.53<1.96，P>0.05兩法測定差異無顯著性說明TB、DB雙試劑測定方法與J-G測定方法一致性良好。
2.6 單、雙試劑測定膽紅素的比較 按NCCLS干擾試驗評價方法 ［2］ 在常規(guī)標(biāo)本中選擇正常血清120例，溶血標(biāo)本40例:Hb1.0～6.0g/L，脂血標(biāo)本（脂濁度在±～3+）TG為1.89～12.7mmol/L黃疸標(biāo)本50例（TB26.9～469.1μmol/L， DB11.6～387.5μmol/L）同時用兩種方法測定，結(jié)果見表2，由表2顯示:溶血、脂血樣品TB 1 、DB 1 明顯高于TB 2 、DB 2 ，無黃疸標(biāo)本DB 1 也明顯高于DB 2 ，黃疸標(biāo)本兩法間差異無顯著性，結(jié)果與文獻 ［3］ 基本一致。
2.7 試劑開瓶試驗 由表3顯示，工作試劑單試劑在7天后使膽紅素測定結(jié)果明顯偏低，雙試劑的工作試劑在60天內(nèi)無明顯變化，（注: ˇ 試劑配制后測定時間均在室溫狀態(tài)下操作，工作完成后再把工作試劑放回2℃～4℃冰箱）。
3 討論
雙試劑方法精密度良好，線性比單試劑明顯提高，雙試劑總膽紅素、直接膽紅素工作液增多為液體雙試劑，經(jīng)試驗證明:雙試劑工作液由于各工作液沒單獨的化學(xué)反應(yīng)，試劑在2℃～4℃，室溫均能穩(wěn)定保存，無需臨時配制工作液，既方便了工作，又提高了工作效率，由于雙蒸水的加入最終使工作液的pH值發(fā)生了變化，緩沖液pH值對完成反應(yīng)及反應(yīng)速度有明顯的變化，隨著pH值的增高，反應(yīng)速度加快，靈敏度增高 ［4］ ，樣品空白、雙波長參數(shù)的設(shè)置可以消除背景的吸收，減少樣品的顏色和濁度所產(chǎn)生的影響，雙波長對電源波動還有些補償效果。（可能這也是雙試劑測定方法線性提高的主要原因，有待探討。）由試驗結(jié)果表明溶血和脂血標(biāo)本嚴(yán)重干擾單試TB 1 、DB 1 法，使血清膽紅素假性增高，這主要歸結(jié)于儀器參數(shù)的選擇問題，單試劑法無法設(shè)置樣品空白，而雙試劑法能夠有樣品空白，這樣就能有效地扣除共存基質(zhì)的干擾，盡可能地排除誤判、錯判正常血清TB測定單、雙試劑變化不明顯 DB單試劑法常高于6μmol/L，黃疸標(biāo)本（無溶血，無脂血）兩法有可比性。雙試劑法（扣除樣品空白的二點終點法）經(jīng)試驗及1年多的臨床證實，確為一種方便、準(zhǔn)確測定血清膽紅素的常規(guī)方法，適用于具有參數(shù)設(shè)置為:雙試劑、樣品空白，雙波長功能的生化分析儀使用。
表1 康寧560主要參數(shù)
注:ˇλ1為主波長，λ2為副波長，雙試劑第一時間點為樣品空白讀數(shù)
表2 單、雙試劑測定膽紅素的比較
注:類標(biāo)本相同項目的方法間比較 ˇˇ P<0.001， ˇ P<0.05
表3 單雙試劑開瓶試驗觀察時間
注:“/”表示沒再測定
參考文獻
1 楊國昌，許葉，張抗.精密度評價和方法比較中NCCLS評價方案的應(yīng)用.臨床檢驗雜志，1999，17（1）:47-49.
2 楊國昌，許葉，張抗.線性評價和干擾試驗中NCCLS價方案的應(yīng)用.臨床檢驗雜志，1999，17（3）:184-186.
3 黃維嘉，陽萍，陳宏礎(chǔ).雙試劑自動分析法測定血清膽紅素.臨床檢驗雜志，1998，17（1）:30-31.
4 邱谷.高碘酸鈉氧化法測定血清總膽紅素.臨床檢驗雜志，2000，18（6）:345-346.