粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能——蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)
粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的主要功能是幫助膜結(jié)合核糖體合成的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。膜結(jié)合核糖體上合成的蛋白質(zhì)與游離核糖體上合成的蛋白質(zhì)去向是不同的，表9-5列出了這兩類核糖體合成的某些蛋白。
表9-5 真核細(xì)胞中膜結(jié)合核糖體和游離核糖體合成的某些蛋白
膜結(jié)合核糖體 游離核糖體
分泌蛋白 可溶性胞質(zhì)溶膠蛋白
肽類激素 脂錨定膜蛋白
生長(zhǎng)因子 （位于質(zhì)膜的胞質(zhì)面）
消化酶類 外周蛋白
血清蛋白 （質(zhì)膜的胞質(zhì)面）
細(xì)胞外基質(zhì)蛋白 核基因編碼的線粒體蛋白
釋放到ER腔中的蛋白 核基因編碼的葉綠體蛋白
RER中的酶類 過(guò)氧化物酶體蛋白
高爾基復(fù)合體的酶 核蛋白
溶酶體的酶
整合膜蛋白
ER膜的糖蛋白
高爾基體的膜糖蛋白
溶酶體膜糖蛋白
質(zhì)膜糖蛋白
核膜糖蛋白
脂錨定質(zhì)膜蛋白
質(zhì)膜的外周蛋白（位于質(zhì)膜的外側(cè)面）
由于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的蛋白質(zhì)包括膜蛋白、內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的腔池蛋白和分泌到細(xì)胞外的蛋白， 所以必須有極好的運(yùn)輸機(jī)制進(jìn)行分選定位， 這就是信號(hào)肽假說(shuō)。
■ 信號(hào)序列的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)
● 微粒體實(shí)驗(yàn)
在George Palade用離心技術(shù)分離到有核糖體結(jié)合的微粒體，即發(fā)現(xiàn)膜結(jié)合核糖體（membrane-bounded ribosome）之后， 科學(xué)家推測(cè)：膜結(jié)合核糖體合成的蛋白質(zhì)首先要進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔，然后通過(guò)選擇性的分泌過(guò)程輸出到細(xì)胞外，而游離核糖體上合成的蛋白質(zhì)則留在細(xì)胞內(nèi)使用。
為了研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的蛋白質(zhì)是否進(jìn)入了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔， Colvin Redman 和 David Sabatini用分離的RER小泡（微粒體）進(jìn)行無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的蛋白質(zhì)合成， 證明了膜結(jié)合核糖體上合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入了微粒體的腔。
如何利用微粒體在無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的合成實(shí)驗(yàn)證明膜結(jié)合核糖體合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入了微粒體的腔
● Günter Blobel等的建議
為什么有些核糖體合成蛋白質(zhì)時(shí)不同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合，有些正在合成蛋白質(zhì)的核糖體要同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合，并將合成的蛋白質(zhì)插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)？對(duì)此，美國(guó)洛克菲勒大學(xué)的 Günter Blobel、David Sabatini 和Bernhard Dobberstein 等于1971年提出兩點(diǎn)建議：
①分泌蛋白的N-端含有一段特別的信號(hào)序列（signal sequence），可將多肽和核糖體引導(dǎo)到ER膜上；②多肽通過(guò)ER膜上的水性通道進(jìn)入ER的腔中，并推測(cè)多肽是在合成的同時(shí)轉(zhuǎn)移的。
● 信號(hào)序列存在的直接證據(jù)
1972年，César Milstein和他的同事用無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)研究免疫球蛋白（IgG）輕鏈合成時(shí)獲得了信號(hào)序列存在的直接證據(jù)， 證明Blobel等的建議是正確的。他們用分離純化的核糖體在無(wú)細(xì)胞體系中用編碼免疫球蛋白輕鏈的mRNA指導(dǎo)合成多肽，發(fā)現(xiàn)合成的多肽比分泌到細(xì)胞外的成熟的免疫球蛋白在N端有一段多出的肽鏈， 它有20個(gè)氨基酸，他們推測(cè)，這段肽具有信號(hào)作用，使IgG得以通過(guò)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并繼而分泌到細(xì)胞外。
● 信號(hào)序列的進(jìn)一步證實(shí)
G.Blobel、B.Dobberstein、P.Walter和他們的同事在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上用分離的微粒體和無(wú)細(xì)胞體系進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了信號(hào)序列的存在及其作用。
加與不加RER小泡，產(chǎn)物不同 當(dāng)將分泌蛋白的mRNA在無(wú)細(xì)胞體系中進(jìn)行翻譯時(shí)， 如果不加粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（微粒體）， 獲得的翻譯產(chǎn)物比從細(xì)胞中分泌出來(lái)的蛋白要長(zhǎng)，若添加RER小泡，翻譯的產(chǎn)物長(zhǎng)度與從活細(xì)胞分泌的蛋白相同。因此推測(cè)信號(hào)序列在引導(dǎo)蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后被切除了，所以成熟的蛋白的N-端沒(méi)有信號(hào)序列。
蛋白水解酶水解實(shí)驗(yàn) 在分泌蛋白進(jìn)行體外翻譯的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中（含有RER小泡）加入蛋白水解酶，并不能使新生肽水解。但同時(shí)加入去垢劑，則能將蛋白質(zhì)水解，提示新生肽鏈?zhǔn)沁吅铣蛇呥\(yùn)輸?shù)模驗(yàn)槿ス竸┠軌蚱茐膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜，使合成的蛋白質(zhì)暴露于蛋白水解酶遭到降解。若無(wú)去垢劑，多肽在合成的同時(shí)就向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)，所以不受蛋白水解酶的影響。
粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的主要功能是幫助膜結(jié)合核糖體合成的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。膜結(jié)合核糖體上合成的蛋白質(zhì)與游離核糖體上合成的蛋白質(zhì)去向是不同的，表9-5列出了這兩類核糖體合成的某些蛋白。
表9-5 真核細(xì)胞中膜結(jié)合核糖體和游離核糖體合成的某些蛋白
膜結(jié)合核糖體 游離核糖體
分泌蛋白 可溶性胞質(zhì)溶膠蛋白
肽類激素 脂錨定膜蛋白
生長(zhǎng)因子 （位于質(zhì)膜的胞質(zhì)面）
消化酶類 外周蛋白
血清蛋白 （質(zhì)膜的胞質(zhì)面）
細(xì)胞外基質(zhì)蛋白 核基因編碼的線粒體蛋白
釋放到ER腔中的蛋白 核基因編碼的葉綠體蛋白
RER中的酶類 過(guò)氧化物酶體蛋白
高爾基復(fù)合體的酶 核蛋白
溶酶體的酶
整合膜蛋白
ER膜的糖蛋白
高爾基體的膜糖蛋白
溶酶體膜糖蛋白
質(zhì)膜糖蛋白
核膜糖蛋白
脂錨定質(zhì)膜蛋白
質(zhì)膜的外周蛋白（位于質(zhì)膜的外側(cè)面）
由于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的蛋白質(zhì)包括膜蛋白、內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的腔池蛋白和分泌到細(xì)胞外的蛋白， 所以必須有極好的運(yùn)輸機(jī)制進(jìn)行分選定位， 這就是信號(hào)肽假說(shuō)。
■ 信號(hào)序列的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)
● 微粒體實(shí)驗(yàn)
在George Palade用離心技術(shù)分離到有核糖體結(jié)合的微粒體，即發(fā)現(xiàn)膜結(jié)合核糖體（membrane-bounded ribosome）之后， 科學(xué)家推測(cè)：膜結(jié)合核糖體合成的蛋白質(zhì)首先要進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔，然后通過(guò)選擇性的分泌過(guò)程輸出到細(xì)胞外，而游離核糖體上合成的蛋白質(zhì)則留在細(xì)胞內(nèi)使用。
為了研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的蛋白質(zhì)是否進(jìn)入了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔， Colvin Redman 和 David Sabatini用分離的RER小泡（微粒體）進(jìn)行無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的蛋白質(zhì)合成， 證明了膜結(jié)合核糖體上合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入了微粒體的腔。
如何利用微粒體在無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的合成實(shí)驗(yàn)證明膜結(jié)合核糖體合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入了微粒體的腔
● Günter Blobel等的建議
為什么有些核糖體合成蛋白質(zhì)時(shí)不同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合，有些正在合成蛋白質(zhì)的核糖體要同內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合，并將合成的蛋白質(zhì)插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)？對(duì)此，美國(guó)洛克菲勒大學(xué)的 Günter Blobel、David Sabatini 和Bernhard Dobberstein 等于1971年提出兩點(diǎn)建議：
①分泌蛋白的N-端含有一段特別的信號(hào)序列（signal sequence），可將多肽和核糖體引導(dǎo)到ER膜上；②多肽通過(guò)ER膜上的水性通道進(jìn)入ER的腔中，并推測(cè)多肽是在合成的同時(shí)轉(zhuǎn)移的。
● 信號(hào)序列存在的直接證據(jù)
1972年，César Milstein和他的同事用無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)研究免疫球蛋白（IgG）輕鏈合成時(shí)獲得了信號(hào)序列存在的直接證據(jù)， 證明Blobel等的建議是正確的。他們用分離純化的核糖體在無(wú)細(xì)胞體系中用編碼免疫球蛋白輕鏈的mRNA指導(dǎo)合成多肽，發(fā)現(xiàn)合成的多肽比分泌到細(xì)胞外的成熟的免疫球蛋白在N端有一段多出的肽鏈， 它有20個(gè)氨基酸，他們推測(cè)，這段肽具有信號(hào)作用，使IgG得以通過(guò)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并繼而分泌到細(xì)胞外。
● 信號(hào)序列的進(jìn)一步證實(shí)
G.Blobel、B.Dobberstein、P.Walter和他們的同事在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上用分離的微粒體和無(wú)細(xì)胞體系進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了信號(hào)序列的存在及其作用。
加與不加RER小泡，產(chǎn)物不同 當(dāng)將分泌蛋白的mRNA在無(wú)細(xì)胞體系中進(jìn)行翻譯時(shí)， 如果不加粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（微粒體）， 獲得的翻譯產(chǎn)物比從細(xì)胞中分泌出來(lái)的蛋白要長(zhǎng)，若添加RER小泡，翻譯的產(chǎn)物長(zhǎng)度與從活細(xì)胞分泌的蛋白相同。因此推測(cè)信號(hào)序列在引導(dǎo)蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后被切除了，所以成熟的蛋白的N-端沒(méi)有信號(hào)序列。
蛋白水解酶水解實(shí)驗(yàn) 在分泌蛋白進(jìn)行體外翻譯的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中（含有RER小泡）加入蛋白水解酶，并不能使新生肽水解。但同時(shí)加入去垢劑，則能將蛋白質(zhì)水解，提示新生肽鏈?zhǔn)沁吅铣蛇呥\(yùn)輸?shù)模驗(yàn)槿ス竸┠軌蚱茐膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜，使合成的蛋白質(zhì)暴露于蛋白水解酶遭到降解。若無(wú)去垢劑，多肽在合成的同時(shí)就向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)，所以不受蛋白水解酶的影響。