[摘要] 目的 建立護(hù)骨素(OPG)基因剔除小鼠胚胎干細(xì)胞雜合子模型，為建立用于研發(fā)抗骨質(zhì)疏松藥物的基因剔除動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。方法 PCR方法擴(kuò)增兩條同源臂，將兩條用于同源重組的片段插入XpPNT載體，構(gòu)建OPG基因敲除打靶載體。線(xiàn)性化及純化以后通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞，并用G418和Gancyclovir進(jìn)行雙藥篩選培養(yǎng)，得到雙藥抗性克隆后抽提基因組DNA，采用PCR和southern雜交方法確定同源重組的胚胎干細(xì)胞克隆。 結(jié)果 經(jīng)雙藥篩選得到124個(gè)雙藥抗性克隆，PCR和southern雜交鑒定獲得一個(gè)發(fā)生同源重組的胚胎干細(xì)胞克隆。結(jié)論 總之，本研究成功獲得了OPG(-/+)雜合子小鼠胚胎干細(xì)胞克隆，為進(jìn)一步通過(guò)顯微注射及交配育種獲得OPG基因剔除小鼠，在活體水平研究OPG基因的功能打下基礎(chǔ)，同時(shí)也使建立用于研發(fā)抗骨質(zhì)疏松藥物的基因剔除動(dòng)物模型成為可能。
[關(guān)鍵詞] 基因敲除；胚胎干細(xì)胞；護(hù)骨素；骨質(zhì)疏松
Establishing the heterozygous model of OPG gene knockout ES cell
QIAO Jianou,ZHOU Longnv,NING Guang,et al.The 9th Peoples Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200232,China
[Abstract] Objective To obtain the homologous recombinant embryonic stem cell (ES cell )with their OPG gene knocked out. Methods A targeting vector pointing to OPG exon 2 and a little part of intron 2 was built with 3.3kb Xbal/BamHI fragment as short arm and 3.9kb NotI/SalI fragment as long arm after two homology arms was got by PCR.The linearized and purified targeting vector DNA was transfected into ES cells through electroporation and then some of these ES cell lines survived G418 and Gancyclovir selection.Twodrugresistant clones were expanded and identified by PCR and Southern blot. Results Totally 124 twodrugresistant clones were harvested and one of them was confirmed as positive. Conclusion The result of this experiment made basis for the further establishment of the OPG knockout mouse model and the deeper study of OPG in vivo.
[Key words] knockout;ES cell;osteoprotegerin;osteoporosis
骨質(zhì)疏松癥是一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨骼脆性增加和易發(fā)生骨折的全身性疾病，也是影響人類(lèi)健康的常見(jiàn)病。如何建立一個(gè)特異的動(dòng)物模型是相關(guān)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。護(hù)骨素(osteoprotegerin,OPG)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有抑制破骨細(xì)胞分化及吸收活性的一種分泌型糖蛋白[1]，屬于腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFR)超家族。研究表明，OPG在骨質(zhì)疏松癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Paget病以及惡性骨組織疾病(骨肉瘤，巨細(xì)胞瘤，轉(zhuǎn)移性癌)等的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防和治療中具有重要作用。本研究利用分子克隆方法，設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對(duì)小鼠OPG基因第2外顯子大部分以及部分第2內(nèi)含子的打靶載體，采用基因打靶的技術(shù)手段，剔除小鼠ES細(xì)胞OPG基因,為進(jìn)一步通過(guò)顯微注射制備OPG基因剔除小鼠模型奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 載體質(zhì)粒pBluescriptⅠⅠ(+/-)和XpPNT質(zhì)粒由上海南方模式生物中心提供，PCR產(chǎn)物克隆載體pGEMTeasy為Promega公司產(chǎn)品。各種限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、隨機(jī)引物法DNA標(biāo)記試劑盒,各種Taq酶、PCR相關(guān)試劑及RTPCR試劑盒等購(gòu)自Takara及NEB公司。DNAmarker(100bp ladder，1kb ladder，Lamda-HindIII fragment)購(gòu)自NEB和Takara公司。蛋白酶K購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司。Trizol購(gòu)自GibcoBRL和Invitrogen公司。質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自華舜生物工程公司和上海生工。質(zhì)粒中抽試劑盒及凝膠回收試劑盒(Quick gel extraction Kit)購(gòu)自Qiagen公司。雜交液ExpressHyb hybrization solution購(gòu)自Clontech公司。常規(guī)化學(xué)試劑主要購(gòu)自Sigma和中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。放射性同位素[α-32P]-dCTP、[α-32P]-dATP為Amersham公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑:包括DMEM液體培養(yǎng)基(high glucose,Lglutamine,no sodium pyravate,EScellqualified)、非必需氨基酸、谷氨酰胺、無(wú)Ca2+/Mg2+的PBS、含Ca2+/Mg2+的PBS、β-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)、胎牛血清(EScellqualified)、G418，Gancyclovir(GANC)、二甲基亞砜(DMSO)、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶(trypsin/EDTA)、膠原(Gelatin)等試劑均為GibcoBRL、Sigma公司產(chǎn)品,LIF(ESGROTM)為CHEMICON(Australia)公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)用35 mm、100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，24孔、48孔和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,離心管等耗材為Corning產(chǎn)品。引物合成和測(cè)序：由上海申友生物技術(shù)公司完成。引物序列用DNAstar軟件包根據(jù)序列資料自行設(shè)計(jì)。ES細(xì)胞株：體外傳至第13代的小鼠，CJ7細(xì)胞系(來(lái)自Sv129小鼠)由上海第二醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳教研室保存。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 打靶載體的構(gòu)建
1.2.1.1 提取ES細(xì)胞基因組DNA 收獲狀態(tài)良好的ES細(xì)胞，加適量裂解液及蛋白酶K，56 ℃過(guò)夜；次日將樣本于室溫12000 rpm離心10 min；取上清液，無(wú)水乙醇沉淀，冰預(yù)冷70%乙醇洗滌；晾干后，適量純水溶解，4 ℃保存?zhèn)溆谩?BR> 1.2.1.2 PCR方法獲得兩條同源臂 以小鼠的OPG基因cDNA序列在Genebank中比對(duì)(BLAST)，獲得小鼠OPG基因序列。根據(jù)NCBI GenBank提供的序列，用DNAstar軟件的Primerselect確定上、下游兩條同源臂的兩對(duì)引物，上游同源臂的上游引物：CGTAGGATCCGTACCTCAGCCTCTGAAGAT(對(duì)應(yīng)OPG基因14842-14861bp) ；下游引物:TCGGTCTAGACAGGAGCTAG AAGAGACACA(對(duì)應(yīng)OPG基因18152-18171bp)；PCR條件：95 ℃，5 min；94 ℃，50 s;60 ℃，50 s;72 ℃，3.5 min。35 cycles:72 ℃，10 min；4 ℃，forever。上游同源臂長(zhǎng)3331 bp。下游同源臂的上游引物：ACCGTCGACAGCCAGACAGCAGCTAACT(對(duì)應(yīng)OPG基因18580~18598bp)下游引物：GTGGCGGCCGCACAGCCAGGACTGTCAACA(對(duì)應(yīng)OPG基因22478~22497bp)；PCR條件為：95 ℃，5 min；94 ℃，50 s;61.5 ℃，50 s;72 ℃，4 min.35 cycles:72 ℃，10 min；4 ℃，forever。下游同源臂長(zhǎng)3918 bp。
1.2.1.3 將DNA片段正確克隆于XpPNT載體 將兩條同源臂的PCR產(chǎn)物回收并連接至PCR產(chǎn)物克隆載體pGEMTeasy，大腸桿菌轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后測(cè)序鑒定。常規(guī)法將下游同源臂以NotI/SalI導(dǎo)入載體XPpnT,再將上游同源臂以Xbal/BamHI插入已經(jīng)含有上游同源臂的XPpnT載體。酶切鑒定及序列測(cè)定表明，連接順序正確，將此打靶載體命名為5-3opg-XpPNT,以NotI酶切線(xiàn)性化，回收，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?BR> 1.2.2 ES細(xì)胞基因打靶
1.2.2.1 ES細(xì)胞電穿孔基因轉(zhuǎn)移 取密度約1.2×107/ml的ES單細(xì)胞懸液0.8 ml，加入含Ca2+和Mg2+的PBS0.1 ml(含約30 μg經(jīng)NotI線(xiàn)性化的5-3opgXpPNT)，混勻后移入無(wú)菌電穿孔杯中。常溫條件下，以240 V，500 μF的電參數(shù)進(jìn)行單脈沖擊發(fā)后，重新懸浮于ES培養(yǎng)基,取細(xì)胞懸液平均接種到2個(gè)膠原化的35 mm平皿中,使用非選擇性培養(yǎng)基復(fù)蘇24 h后進(jìn)行藥物篩選。
1.2.2.2 藥物篩選抗性細(xì)胞 在細(xì)胞電穿孔基因轉(zhuǎn)移后24 h開(kāi)始進(jìn)行藥物選擇。其中1個(gè)30 mm的平皿使用含有選擇藥物G418(終濃度為400 g/ml)和Gancyclovir(終濃度為2 mmol/L)的培養(yǎng)液進(jìn)行選擇性細(xì)胞培養(yǎng)，另1個(gè)平皿仍然使用非選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對(duì)照。經(jīng)7~8天篩選，ES細(xì)胞克隆長(zhǎng)成肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞集落，即可進(jìn)行挑取。14天共挑取藥物抗性細(xì)胞克隆124個(gè)。
[關(guān)鍵詞] 基因敲除；胚胎干細(xì)胞；護(hù)骨素；骨質(zhì)疏松
Establishing the heterozygous model of OPG gene knockout ES cell
QIAO Jianou,ZHOU Longnv,NING Guang,et al.The 9th Peoples Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200232,China
[Abstract] Objective To obtain the homologous recombinant embryonic stem cell (ES cell )with their OPG gene knocked out. Methods A targeting vector pointing to OPG exon 2 and a little part of intron 2 was built with 3.3kb Xbal/BamHI fragment as short arm and 3.9kb NotI/SalI fragment as long arm after two homology arms was got by PCR.The linearized and purified targeting vector DNA was transfected into ES cells through electroporation and then some of these ES cell lines survived G418 and Gancyclovir selection.Twodrugresistant clones were expanded and identified by PCR and Southern blot. Results Totally 124 twodrugresistant clones were harvested and one of them was confirmed as positive. Conclusion The result of this experiment made basis for the further establishment of the OPG knockout mouse model and the deeper study of OPG in vivo.
[Key words] knockout;ES cell;osteoprotegerin;osteoporosis
骨質(zhì)疏松癥是一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨骼脆性增加和易發(fā)生骨折的全身性疾病，也是影響人類(lèi)健康的常見(jiàn)病。如何建立一個(gè)特異的動(dòng)物模型是相關(guān)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。護(hù)骨素(osteoprotegerin,OPG)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有抑制破骨細(xì)胞分化及吸收活性的一種分泌型糖蛋白[1]，屬于腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFR)超家族。研究表明，OPG在骨質(zhì)疏松癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Paget病以及惡性骨組織疾病(骨肉瘤，巨細(xì)胞瘤，轉(zhuǎn)移性癌)等的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防和治療中具有重要作用。本研究利用分子克隆方法，設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對(duì)小鼠OPG基因第2外顯子大部分以及部分第2內(nèi)含子的打靶載體，采用基因打靶的技術(shù)手段，剔除小鼠ES細(xì)胞OPG基因,為進(jìn)一步通過(guò)顯微注射制備OPG基因剔除小鼠模型奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 載體質(zhì)粒pBluescriptⅠⅠ(+/-)和XpPNT質(zhì)粒由上海南方模式生物中心提供，PCR產(chǎn)物克隆載體pGEMTeasy為Promega公司產(chǎn)品。各種限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、隨機(jī)引物法DNA標(biāo)記試劑盒,各種Taq酶、PCR相關(guān)試劑及RTPCR試劑盒等購(gòu)自Takara及NEB公司。DNAmarker(100bp ladder，1kb ladder，Lamda-HindIII fragment)購(gòu)自NEB和Takara公司。蛋白酶K購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司。Trizol購(gòu)自GibcoBRL和Invitrogen公司。質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自華舜生物工程公司和上海生工。質(zhì)粒中抽試劑盒及凝膠回收試劑盒(Quick gel extraction Kit)購(gòu)自Qiagen公司。雜交液ExpressHyb hybrization solution購(gòu)自Clontech公司。常規(guī)化學(xué)試劑主要購(gòu)自Sigma和中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。放射性同位素[α-32P]-dCTP、[α-32P]-dATP為Amersham公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑:包括DMEM液體培養(yǎng)基(high glucose,Lglutamine,no sodium pyravate,EScellqualified)、非必需氨基酸、谷氨酰胺、無(wú)Ca2+/Mg2+的PBS、含Ca2+/Mg2+的PBS、β-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)、胎牛血清(EScellqualified)、G418，Gancyclovir(GANC)、二甲基亞砜(DMSO)、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶(trypsin/EDTA)、膠原(Gelatin)等試劑均為GibcoBRL、Sigma公司產(chǎn)品,LIF(ESGROTM)為CHEMICON(Australia)公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)用35 mm、100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，24孔、48孔和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,離心管等耗材為Corning產(chǎn)品。引物合成和測(cè)序：由上海申友生物技術(shù)公司完成。引物序列用DNAstar軟件包根據(jù)序列資料自行設(shè)計(jì)。ES細(xì)胞株：體外傳至第13代的小鼠，CJ7細(xì)胞系(來(lái)自Sv129小鼠)由上海第二醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳教研室保存。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 打靶載體的構(gòu)建
1.2.1.1 提取ES細(xì)胞基因組DNA 收獲狀態(tài)良好的ES細(xì)胞，加適量裂解液及蛋白酶K，56 ℃過(guò)夜；次日將樣本于室溫12000 rpm離心10 min；取上清液，無(wú)水乙醇沉淀，冰預(yù)冷70%乙醇洗滌；晾干后，適量純水溶解，4 ℃保存?zhèn)溆谩?BR> 1.2.1.2 PCR方法獲得兩條同源臂 以小鼠的OPG基因cDNA序列在Genebank中比對(duì)(BLAST)，獲得小鼠OPG基因序列。根據(jù)NCBI GenBank提供的序列，用DNAstar軟件的Primerselect確定上、下游兩條同源臂的兩對(duì)引物，上游同源臂的上游引物：CGTAGGATCCGTACCTCAGCCTCTGAAGAT(對(duì)應(yīng)OPG基因14842-14861bp) ；下游引物:TCGGTCTAGACAGGAGCTAG AAGAGACACA(對(duì)應(yīng)OPG基因18152-18171bp)；PCR條件：95 ℃，5 min；94 ℃，50 s;60 ℃，50 s;72 ℃，3.5 min。35 cycles:72 ℃，10 min；4 ℃，forever。上游同源臂長(zhǎng)3331 bp。下游同源臂的上游引物：ACCGTCGACAGCCAGACAGCAGCTAACT(對(duì)應(yīng)OPG基因18580~18598bp)下游引物：GTGGCGGCCGCACAGCCAGGACTGTCAACA(對(duì)應(yīng)OPG基因22478~22497bp)；PCR條件為：95 ℃，5 min；94 ℃，50 s;61.5 ℃，50 s;72 ℃，4 min.35 cycles:72 ℃，10 min；4 ℃，forever。下游同源臂長(zhǎng)3918 bp。
1.2.1.3 將DNA片段正確克隆于XpPNT載體 將兩條同源臂的PCR產(chǎn)物回收并連接至PCR產(chǎn)物克隆載體pGEMTeasy，大腸桿菌轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后測(cè)序鑒定。常規(guī)法將下游同源臂以NotI/SalI導(dǎo)入載體XPpnT,再將上游同源臂以Xbal/BamHI插入已經(jīng)含有上游同源臂的XPpnT載體。酶切鑒定及序列測(cè)定表明，連接順序正確，將此打靶載體命名為5-3opg-XpPNT,以NotI酶切線(xiàn)性化，回收，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?BR> 1.2.2 ES細(xì)胞基因打靶
1.2.2.1 ES細(xì)胞電穿孔基因轉(zhuǎn)移 取密度約1.2×107/ml的ES單細(xì)胞懸液0.8 ml，加入含Ca2+和Mg2+的PBS0.1 ml(含約30 μg經(jīng)NotI線(xiàn)性化的5-3opgXpPNT)，混勻后移入無(wú)菌電穿孔杯中。常溫條件下，以240 V，500 μF的電參數(shù)進(jìn)行單脈沖擊發(fā)后，重新懸浮于ES培養(yǎng)基,取細(xì)胞懸液平均接種到2個(gè)膠原化的35 mm平皿中,使用非選擇性培養(yǎng)基復(fù)蘇24 h后進(jìn)行藥物篩選。
1.2.2.2 藥物篩選抗性細(xì)胞 在細(xì)胞電穿孔基因轉(zhuǎn)移后24 h開(kāi)始進(jìn)行藥物選擇。其中1個(gè)30 mm的平皿使用含有選擇藥物G418(終濃度為400 g/ml)和Gancyclovir(終濃度為2 mmol/L)的培養(yǎng)液進(jìn)行選擇性細(xì)胞培養(yǎng)，另1個(gè)平皿仍然使用非選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對(duì)照。經(jīng)7~8天篩選，ES細(xì)胞克隆長(zhǎng)成肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞集落，即可進(jìn)行挑取。14天共挑取藥物抗性細(xì)胞克隆124個(gè)。