分子排阻色譜法是根據(jù)分子大小進(jìn)行分離的一種液相色譜技術(shù)。分子排阻色譜法的分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機(jī)制。色譜柱多以親水硅膠、凝膠或經(jīng)修飾凝膠如葡聚糖凝膠Sephadex和聚丙烯酰胺凝膠Sepherose等為填充劑，這些填充劑表面分布著不同尺寸的孔徑，藥物分子進(jìn)入色譜柱后，它們中的不同組分按其大小進(jìn)入相應(yīng)的孔徑內(nèi)，大小大于所有孔徑的分子不能進(jìn)入填充劑顆粒內(nèi)部，在色譜過程中不被保留，最早被流動(dòng)相洗脫至柱外，表現(xiàn)為保留時(shí)間較短；大小小于所有孔徑的分子能自由進(jìn)入填充劑表面的所有孔徑，在柱子中滯留時(shí)間較長(zhǎng)，表現(xiàn)為保留時(shí)間較長(zhǎng)；其余分子則按分子大小依次被洗脫。
1．對(duì)儀器的一般要求來源:考試大
分子排阻色譜法所需的進(jìn)樣器和檢測(cè)器同高效液相色譜法，液相色譜泵一般分常壓、中壓和高壓。在藥物分析中尤其是分子量或分子量分布通常采用高效分子排阻色譜法（HPSEC）。應(yīng)選用與供試品分子大小相適應(yīng)的色譜柱填充劑。使用的流動(dòng)相通常為水溶液或緩沖液，溶液的pH值不宜超出填充劑的耐受力，一般pH值在2～8范圍。流動(dòng)相中可進(jìn)入適量的有機(jī)溶劑，但不宜過濃，一般不應(yīng)超過30%，流速不宜過高，一般為0.5～1.0ml/min.
2．系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
高效分子排阻色譜法的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中（1）色譜柱的理論板數(shù)（n）、（2）分離度、（3）重復(fù)性、（4）拖尾因子的測(cè)定方法，在一般情況下，同高效液相色譜法項(xiàng)下方法，但在高分子雜質(zhì)檢查時(shí)，某些藥物分子的單體與其二聚體不能達(dá)到基線分離時(shí)，其分離度的計(jì)算公式為：
除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)小于2.0。
3．測(cè)定法
（1）分子量測(cè)定法
按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，一般適用蛋白質(zhì)多肽的分子量測(cè)定。選用與供試品分子大小相適宜的色譜柱和適宜分子量范圍的對(duì)照品，除另有規(guī)定外，對(duì)照品與供試品均需使用二硫蘇糖醇（DTT）和十二烷基硫酸鈉（SDS）處理，以打開分子內(nèi)和分子間的二硫鍵，并使分子的構(gòu)型與構(gòu)象趨于一致，經(jīng)處理的蛋白質(zhì)和多肽分子通常以線性形式分離，以對(duì)照品分子量（MW）的對(duì)數(shù)對(duì)相應(yīng)的保留時(shí)間（tR）制得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程logMW=a+b tR，供試品以保留時(shí)間由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算其分子量或亞基的分子量。
（2）生物大分子聚合物分子量與分子量分布的測(cè)定法
生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和膠原蛋白等具有分子大小不均一的特點(diǎn)，故生物大分子聚合物分子量與分子量分布是控制該類產(chǎn)品的關(guān)鍵指標(biāo)。在生物大分子聚合物分子量與分子量分布測(cè)定時(shí)，選用與供試品分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)相同或相似的對(duì)照品十分重要。
按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，除另有規(guī)定外，同樣采用分子量對(duì)照品和適宜的GPC軟件制得對(duì)照品重均分子量（MW）的對(duì)數(shù)對(duì)相應(yīng)的保留時(shí)間（tR）制得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程logMW=a+btR，供試品采用適宜的GPC軟件處理結(jié)果，并按下列公式計(jì)算出供試品的分子量與分子量分布。
Mn=∑RIi/∑（RIi/Mi）
MW=∑（RIiMi）i/∑RI
D=MW/Mn
式中Mn為數(shù)均分子量；
MW為重均分子量；
D為分布系數(shù)；
RIi為供試品在保留時(shí)間i時(shí)的峰高；
Mi為供試品在保留時(shí)間時(shí)的分子量。
（3）高分子雜質(zhì)測(cè)定法
高分子雜質(zhì)系指藥品中分子量大于藥物分子的雜質(zhì)，通常是藥物在生產(chǎn)或貯存過程中產(chǎn)生的高分子聚合物和生產(chǎn)過程中未除盡的可能產(chǎn)生過敏反應(yīng)的高分子物質(zhì)。
在正文品種規(guī)定的色譜條件下進(jìn)行分離。
定量方法
①主成分自身對(duì)照法同高效液相色譜法項(xiàng)下規(guī)定。一般用于高分子雜質(zhì)含量較低的品種。
②面積歸一化法同高效液相色譜法項(xiàng)下規(guī)定。
③限量法除另有規(guī)定外，規(guī)定不得檢出保留時(shí)間小于對(duì)照品保留時(shí)間的組分，一般用于混合物中高分子物質(zhì)的控制。
④自身對(duì)照外標(biāo)法一般用于SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中β-內(nèi)酰胺抗生素中高分子雜質(zhì)的檢查。在該分離系統(tǒng)中，除部分寡聚物外，β-內(nèi)酰胺抗生素中高分子雜質(zhì)在色譜過程中均不保留，即所有的高分子雜質(zhì)表現(xiàn)為單一的色譜峰，以藥物自身為對(duì)照品，按外標(biāo)法計(jì)算藥品中高分子雜質(zhì)的相對(duì)百分含量。
［附注］SephadexG-10的處理方法。
色譜柱的填裝裝柱前先將約15g葡聚糖凝膠SephadexG-10用水浸泡48小時(shí)，使之充分溶脹，攪拌除去空氣泡，徐徐傾入玻璃柱，一次性裝滿，然后用水將附著玻璃管壁的SephadexG-10洗下，使色譜柱面平整，新填裝的色譜柱要先用水連續(xù)沖洗4～6小時(shí)，以排出柱中的氣泡。
樣品的加入進(jìn)樣可以采用自動(dòng)進(jìn)樣閥，也可以直接將樣品加在床的表面（此時(shí)，先將床表面的流動(dòng)相吸干，將樣品溶液沿著色譜管壁轉(zhuǎn)圈緩緩加入，注意勿使填充劑翻起，待之隨著重力的作用滲入固定相后，再沿著色譜管壁轉(zhuǎn)圈緩緩加入3～5mL流動(dòng)相，以洗下殘留在色譜管壁的樣品溶液）。
1．對(duì)儀器的一般要求來源:考試大
分子排阻色譜法所需的進(jìn)樣器和檢測(cè)器同高效液相色譜法，液相色譜泵一般分常壓、中壓和高壓。在藥物分析中尤其是分子量或分子量分布通常采用高效分子排阻色譜法（HPSEC）。應(yīng)選用與供試品分子大小相適應(yīng)的色譜柱填充劑。使用的流動(dòng)相通常為水溶液或緩沖液，溶液的pH值不宜超出填充劑的耐受力，一般pH值在2～8范圍。流動(dòng)相中可進(jìn)入適量的有機(jī)溶劑，但不宜過濃，一般不應(yīng)超過30%，流速不宜過高，一般為0.5～1.0ml/min.
2．系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
高效分子排阻色譜法的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中（1）色譜柱的理論板數(shù)（n）、（2）分離度、（3）重復(fù)性、（4）拖尾因子的測(cè)定方法，在一般情況下，同高效液相色譜法項(xiàng)下方法，但在高分子雜質(zhì)檢查時(shí)，某些藥物分子的單體與其二聚體不能達(dá)到基線分離時(shí)，其分離度的計(jì)算公式為：
除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)小于2.0。
3．測(cè)定法
（1）分子量測(cè)定法
按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，一般適用蛋白質(zhì)多肽的分子量測(cè)定。選用與供試品分子大小相適宜的色譜柱和適宜分子量范圍的對(duì)照品，除另有規(guī)定外，對(duì)照品與供試品均需使用二硫蘇糖醇（DTT）和十二烷基硫酸鈉（SDS）處理，以打開分子內(nèi)和分子間的二硫鍵，并使分子的構(gòu)型與構(gòu)象趨于一致，經(jīng)處理的蛋白質(zhì)和多肽分子通常以線性形式分離，以對(duì)照品分子量（MW）的對(duì)數(shù)對(duì)相應(yīng)的保留時(shí)間（tR）制得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程logMW=a+b tR，供試品以保留時(shí)間由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算其分子量或亞基的分子量。
（2）生物大分子聚合物分子量與分子量分布的測(cè)定法
生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和膠原蛋白等具有分子大小不均一的特點(diǎn)，故生物大分子聚合物分子量與分子量分布是控制該類產(chǎn)品的關(guān)鍵指標(biāo)。在生物大分子聚合物分子量與分子量分布測(cè)定時(shí)，選用與供試品分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)相同或相似的對(duì)照品十分重要。
按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，除另有規(guī)定外，同樣采用分子量對(duì)照品和適宜的GPC軟件制得對(duì)照品重均分子量（MW）的對(duì)數(shù)對(duì)相應(yīng)的保留時(shí)間（tR）制得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程logMW=a+btR，供試品采用適宜的GPC軟件處理結(jié)果，并按下列公式計(jì)算出供試品的分子量與分子量分布。
Mn=∑RIi/∑（RIi/Mi）
MW=∑（RIiMi）i/∑RI
D=MW/Mn
式中Mn為數(shù)均分子量；
MW為重均分子量；
D為分布系數(shù)；
RIi為供試品在保留時(shí)間i時(shí)的峰高；
Mi為供試品在保留時(shí)間時(shí)的分子量。
（3）高分子雜質(zhì)測(cè)定法
高分子雜質(zhì)系指藥品中分子量大于藥物分子的雜質(zhì)，通常是藥物在生產(chǎn)或貯存過程中產(chǎn)生的高分子聚合物和生產(chǎn)過程中未除盡的可能產(chǎn)生過敏反應(yīng)的高分子物質(zhì)。
在正文品種規(guī)定的色譜條件下進(jìn)行分離。
定量方法
①主成分自身對(duì)照法同高效液相色譜法項(xiàng)下規(guī)定。一般用于高分子雜質(zhì)含量較低的品種。
②面積歸一化法同高效液相色譜法項(xiàng)下規(guī)定。
③限量法除另有規(guī)定外，規(guī)定不得檢出保留時(shí)間小于對(duì)照品保留時(shí)間的組分，一般用于混合物中高分子物質(zhì)的控制。
④自身對(duì)照外標(biāo)法一般用于SephadexG-10凝膠色譜系統(tǒng)中β-內(nèi)酰胺抗生素中高分子雜質(zhì)的檢查。在該分離系統(tǒng)中，除部分寡聚物外，β-內(nèi)酰胺抗生素中高分子雜質(zhì)在色譜過程中均不保留，即所有的高分子雜質(zhì)表現(xiàn)為單一的色譜峰，以藥物自身為對(duì)照品，按外標(biāo)法計(jì)算藥品中高分子雜質(zhì)的相對(duì)百分含量。
［附注］SephadexG-10的處理方法。
色譜柱的填裝裝柱前先將約15g葡聚糖凝膠SephadexG-10用水浸泡48小時(shí)，使之充分溶脹，攪拌除去空氣泡，徐徐傾入玻璃柱，一次性裝滿，然后用水將附著玻璃管壁的SephadexG-10洗下，使色譜柱面平整，新填裝的色譜柱要先用水連續(xù)沖洗4～6小時(shí)，以排出柱中的氣泡。
樣品的加入進(jìn)樣可以采用自動(dòng)進(jìn)樣閥，也可以直接將樣品加在床的表面（此時(shí)，先將床表面的流動(dòng)相吸干，將樣品溶液沿著色譜管壁轉(zhuǎn)圈緩緩加入，注意勿使填充劑翻起，待之隨著重力的作用滲入固定相后，再沿著色譜管壁轉(zhuǎn)圈緩緩加入3～5mL流動(dòng)相，以洗下殘留在色譜管壁的樣品溶液）。