色譜法
☆ ☆考點(diǎn)1：色譜法總論
1．色譜法
是一種物理或物理化學(xué)分離分析方法。即先將混合物中各組分分離，而后逐個(gè)分析，因此是分析混合物最有力的手段。色譜法具有高靈敏度、高選擇性、高效能、分析速度快及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，在各國(guó)藥典中廣泛用作藥品定性鑒別、純度檢查和含量測(cè)定的法定方法?！吨袊?guó)藥典》(2005年版)收載的色譜法有薄層色譜法（TLC）、氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）。
2．分類
色譜法可以從不同的角度進(jìn)行分類，按流動(dòng)相與固定相的分子聚集狀態(tài)分類，若流動(dòng)相是氣體和液體，可分為氣相色譜法和液相色譜法；按固定相分為固體或液體，氣相色譜法又可進(jìn)一步分為氣-固或氣-液色譜法；液相色譜法又可分為液-固或液-液色譜法。按操作形式可分為柱色譜法、平面色譜法、電泳法等。按分離機(jī)制可分為分配色譜法、吸附色譜法、離子交換色譜法、空間排阻色譜法及親和色譜法等類型。
3．色譜過程
是物質(zhì)分子在相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相（固定相和流動(dòng)相）間分配平衡的過程，可以用分配系數(shù)（K）和容量因子（k）來描述。
（1）分配系數(shù)：組分在固定相和流動(dòng)相之間分配平衡時(shí)的濃度之比稱為分配系數(shù)。即：
K＝CS/Cm
式中，CS--平衡時(shí)組分在固定相中的濃度；Cm--平衡時(shí)組分在流動(dòng)相中的濃度。
分配系數(shù)與組分、固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)及溫度有關(guān)。色譜法是利用組分在固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)的差異而實(shí)現(xiàn)分離的。
（2）容量因子：又稱為質(zhì)量分配系數(shù)，即達(dá)到分配平衡后，組分在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量之比：
k=WS/Wm
式中，WS--平衡時(shí)組分在固定相中的質(zhì)量；Wm--平衡時(shí)組分在流動(dòng)相中的質(zhì)量。
容量因子與分配系數(shù)有如下關(guān)系：
k=CSVS/CmVm=KVS/Vm
式中，VS--固定相的體積；Vm--流動(dòng)相的體積。
容量因子不僅與組分、固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)及溫度有關(guān)，而且還與兩相的體積有關(guān)。在實(shí)際工作中，容量因子比分配系數(shù)更容易測(cè)定，因此常用容量因子代替分配系數(shù)。組分的容量因子不等是色譜分離的先決條件。
4．色譜過程方程
即保留時(shí)間與分配系數(shù)（或分配比）之間的關(guān)系：
tR=t0（1+KVS/Vm）=t0（1+k）
式中，tR--組分的保留時(shí)間；t0--死時(shí)間。色譜過程方程是色譜法的最基本公式之一。
☆ ☆☆☆考點(diǎn)2：薄層色譜法
1．基本原理
將固定相均勻地涂布在具有光潔表面的玻璃、塑料或金屬板上形成薄層，在此薄層上進(jìn)行色譜分離的方法稱為薄層色譜法（TLC）。
（1）吸附薄層色譜：固定相為吸附劑的薄層色譜法稱為吸附薄層色譜法。
分離原理：組分在吸附劑與異型劑之間發(fā)生連續(xù)不斷的吸附、解吸、再吸附、再解吸，產(chǎn)生差速遷移得到分離。例如：將A、B兩組分的混合溶液點(diǎn)在薄層板的一端，在密閉的容器中用適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相（展開劑）展開。此時(shí)A、B不斷地被吸附劑所吸附，又被展開劑所溶解而解吸，且隨展開劑向前移動(dòng)。由于吸附劑對(duì)A和B具有不同的吸附能力，展開劑也對(duì)A和B有不同的溶解、解吸能力，即KA≠KB，因此當(dāng)展開劑不斷展開，A、B在吸附劑和展開劑之間發(fā)生連續(xù)不斷的吸附、解吸，從而產(chǎn)生差速遷移得到分離。K值越大的組分隨展開劑移動(dòng)的速度越慢。如下圖：
（2）比移值：組分的遷移距離（l）與展開劑的遷移距離（l0）之比稱為比移值（Rf）。
Rf＝l/l0
式中，l--原點(diǎn)至某組分斑點(diǎn)中心（質(zhì)量重心）的距離；l0--原點(diǎn)至展開劑前沿的距離。實(shí)踐中，Rf值的范圍是0.3～0.5，可用范圍是0.2～0.8。比移值描述組分斑點(diǎn)的位置，是薄層色譜的基本定性參數(shù)。
影響比移值的因素主要包括：①被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。在硅膠薄層板上，極性較強(qiáng)的組分Rf值較小。②薄層板的性質(zhì)。吸附劑的活性越強(qiáng)，其吸附作用就越強(qiáng)，使組分的Rf值越小。③展開劑的性質(zhì)。極性越強(qiáng)的展開劑與吸附劑的作用越強(qiáng)，使組分與吸附劑的作用相對(duì)減弱，Rf值增大。④展開室內(nèi)的展開劑蒸氣飽和程度對(duì)Rf值也有較大影響。
（3）分離度：兩相鄰斑點(diǎn)中心距離與兩斑點(diǎn)平均寬度（直徑）的比值稱為分離度或分辨率。分離度是衡量TLC系統(tǒng)好壞的參數(shù)。
R=2d/（W1＋W2）
式中，d--兩斑點(diǎn)中心間的距離；W1--斑點(diǎn)1的寬度；W2--斑點(diǎn)2的寬度。
2．操作方法
（1）吸附劑和展開劑。常用吸附劑有硅膠、氧化鋁、聚酰胺，還有硅藻土、纖維素等。硅醇基是使硅膠具有吸附力的活性基團(tuán)，水能與硅膠表面羥基結(jié)合而使其失去活性。硅膠的含水量越高，則活性越低，吸附力越弱。硅膠在105～110℃加熱30分鐘，使硅膠吸附力增強(qiáng)的過程稱為“活化”。
薄層色譜常用硅膠有硅膠H（不含黏合劑）、硅膠G（含黏合劑和煅石膏）和硅膠HF254（不含黏合劑而含有熒光劑）等。同樣，氧化鋁也分為氧化鋁G、氧化鋁H和氧化鋁HF254等。
極性較強(qiáng)的組分選擇極性較強(qiáng)的展開劑，極性較弱的組分選擇極性較弱的展開劑。展開劑的選擇要使組分的Rf值在0.3～0.5范圍內(nèi)為宜。
（2）薄層板的制備。將1份固定相和3份水在研缽中研磨，均勻涂于玻璃板上，室溫晾干后于110℃加熱30分鐘，置干燥器中備用。
（3）點(diǎn)樣與展開。用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣于薄層板上，一般為圓點(diǎn)，點(diǎn)樣基線距底2.0cm，樣點(diǎn)直徑以2～4mm為宜，點(diǎn)間距離為1.5～2.0cm，點(diǎn)樣時(shí)勿損傷薄層表面。將點(diǎn)好樣品的薄層板放入層析缸的展開劑中，浸入展開劑的深度為距薄層底邊0.5～1.0cm（切勿將樣品浸入展開劑中），密封室蓋，待展開至規(guī)定距離（一般為10～15cm）后，取出薄層板，標(biāo)記好前沿，晾干。
薄層色譜的展開方式多為上行法，還有下行展開、雙向展開、多次展開等多種方式。
（4）斑點(diǎn)的定位。進(jìn)行定性或定量前都必須確定組分在薄層板上的位置，即定位。定位的方式有直接目視法、顯色法、紫外燈下觀察熒光法、熒光淬滅法等。
3．應(yīng)用
（1）鑒別。比較供試液與對(duì)照液的比移值。將兩種溶液點(diǎn)于同一薄層板上，展開后比較兩者的Rf，應(yīng)一致。
（2）雜質(zhì)檢查
①雜質(zhì)對(duì)照品比較法。配制一定濃度的供試品溶液和規(guī)定限度濃度的雜質(zhì)對(duì)照品溶液，點(diǎn)樣、展開、檢測(cè)后比較，供試品中相應(yīng)雜質(zhì)斑點(diǎn)的顏色應(yīng)不深于雜質(zhì)對(duì)照品的斑點(diǎn)顏色。
②高低濃度對(duì)比法（主成分自身對(duì)照法）。先配制一定濃度的供試品溶液，然后稀釋一定倍數(shù)得到另一低濃度溶液，作為對(duì)照溶液。將兩種溶液點(diǎn)樣，展開后，比較所得斑點(diǎn)。供試品溶液中雜質(zhì)斑點(diǎn)的顏色不得深于對(duì)照溶液的主斑點(diǎn)（有的還規(guī)定供試品溶液雜質(zhì)斑點(diǎn)個(gè)數(shù)不得超過幾個(gè)）。
③檢測(cè)限法。配制一定濃度的供試品溶液，點(diǎn)樣、展開后，檢查。要求供試品溶液中不得出現(xiàn)雜質(zhì)斑點(diǎn)。
☆ ☆考點(diǎn)1：色譜法總論
1．色譜法
是一種物理或物理化學(xué)分離分析方法。即先將混合物中各組分分離，而后逐個(gè)分析，因此是分析混合物最有力的手段。色譜法具有高靈敏度、高選擇性、高效能、分析速度快及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，在各國(guó)藥典中廣泛用作藥品定性鑒別、純度檢查和含量測(cè)定的法定方法?！吨袊?guó)藥典》(2005年版)收載的色譜法有薄層色譜法（TLC）、氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）。
2．分類
色譜法可以從不同的角度進(jìn)行分類，按流動(dòng)相與固定相的分子聚集狀態(tài)分類，若流動(dòng)相是氣體和液體，可分為氣相色譜法和液相色譜法；按固定相分為固體或液體，氣相色譜法又可進(jìn)一步分為氣-固或氣-液色譜法；液相色譜法又可分為液-固或液-液色譜法。按操作形式可分為柱色譜法、平面色譜法、電泳法等。按分離機(jī)制可分為分配色譜法、吸附色譜法、離子交換色譜法、空間排阻色譜法及親和色譜法等類型。
3．色譜過程
是物質(zhì)分子在相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相（固定相和流動(dòng)相）間分配平衡的過程，可以用分配系數(shù)（K）和容量因子（k）來描述。
（1）分配系數(shù)：組分在固定相和流動(dòng)相之間分配平衡時(shí)的濃度之比稱為分配系數(shù)。即：
K＝CS/Cm
式中，CS--平衡時(shí)組分在固定相中的濃度；Cm--平衡時(shí)組分在流動(dòng)相中的濃度。
分配系數(shù)與組分、固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)及溫度有關(guān)。色譜法是利用組分在固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)的差異而實(shí)現(xiàn)分離的。
（2）容量因子：又稱為質(zhì)量分配系數(shù)，即達(dá)到分配平衡后，組分在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量之比：
k=WS/Wm
式中，WS--平衡時(shí)組分在固定相中的質(zhì)量；Wm--平衡時(shí)組分在流動(dòng)相中的質(zhì)量。
容量因子與分配系數(shù)有如下關(guān)系：
k=CSVS/CmVm=KVS/Vm
式中，VS--固定相的體積；Vm--流動(dòng)相的體積。
容量因子不僅與組分、固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)及溫度有關(guān)，而且還與兩相的體積有關(guān)。在實(shí)際工作中，容量因子比分配系數(shù)更容易測(cè)定，因此常用容量因子代替分配系數(shù)。組分的容量因子不等是色譜分離的先決條件。
4．色譜過程方程
即保留時(shí)間與分配系數(shù)（或分配比）之間的關(guān)系：
tR=t0（1+KVS/Vm）=t0（1+k）
式中，tR--組分的保留時(shí)間；t0--死時(shí)間。色譜過程方程是色譜法的最基本公式之一。
☆ ☆☆☆考點(diǎn)2：薄層色譜法
1．基本原理
將固定相均勻地涂布在具有光潔表面的玻璃、塑料或金屬板上形成薄層，在此薄層上進(jìn)行色譜分離的方法稱為薄層色譜法（TLC）。
（1）吸附薄層色譜：固定相為吸附劑的薄層色譜法稱為吸附薄層色譜法。
分離原理：組分在吸附劑與異型劑之間發(fā)生連續(xù)不斷的吸附、解吸、再吸附、再解吸，產(chǎn)生差速遷移得到分離。例如：將A、B兩組分的混合溶液點(diǎn)在薄層板的一端，在密閉的容器中用適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相（展開劑）展開。此時(shí)A、B不斷地被吸附劑所吸附，又被展開劑所溶解而解吸，且隨展開劑向前移動(dòng)。由于吸附劑對(duì)A和B具有不同的吸附能力，展開劑也對(duì)A和B有不同的溶解、解吸能力，即KA≠KB，因此當(dāng)展開劑不斷展開，A、B在吸附劑和展開劑之間發(fā)生連續(xù)不斷的吸附、解吸，從而產(chǎn)生差速遷移得到分離。K值越大的組分隨展開劑移動(dòng)的速度越慢。如下圖：
（2）比移值：組分的遷移距離（l）與展開劑的遷移距離（l0）之比稱為比移值（Rf）。
Rf＝l/l0
式中，l--原點(diǎn)至某組分斑點(diǎn)中心（質(zhì)量重心）的距離；l0--原點(diǎn)至展開劑前沿的距離。實(shí)踐中，Rf值的范圍是0.3～0.5，可用范圍是0.2～0.8。比移值描述組分斑點(diǎn)的位置，是薄層色譜的基本定性參數(shù)。
影響比移值的因素主要包括：①被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。在硅膠薄層板上，極性較強(qiáng)的組分Rf值較小。②薄層板的性質(zhì)。吸附劑的活性越強(qiáng)，其吸附作用就越強(qiáng)，使組分的Rf值越小。③展開劑的性質(zhì)。極性越強(qiáng)的展開劑與吸附劑的作用越強(qiáng)，使組分與吸附劑的作用相對(duì)減弱，Rf值增大。④展開室內(nèi)的展開劑蒸氣飽和程度對(duì)Rf值也有較大影響。
（3）分離度：兩相鄰斑點(diǎn)中心距離與兩斑點(diǎn)平均寬度（直徑）的比值稱為分離度或分辨率。分離度是衡量TLC系統(tǒng)好壞的參數(shù)。
R=2d/（W1＋W2）
式中，d--兩斑點(diǎn)中心間的距離；W1--斑點(diǎn)1的寬度；W2--斑點(diǎn)2的寬度。
2．操作方法
（1）吸附劑和展開劑。常用吸附劑有硅膠、氧化鋁、聚酰胺，還有硅藻土、纖維素等。硅醇基是使硅膠具有吸附力的活性基團(tuán)，水能與硅膠表面羥基結(jié)合而使其失去活性。硅膠的含水量越高，則活性越低，吸附力越弱。硅膠在105～110℃加熱30分鐘，使硅膠吸附力增強(qiáng)的過程稱為“活化”。
薄層色譜常用硅膠有硅膠H（不含黏合劑）、硅膠G（含黏合劑和煅石膏）和硅膠HF254（不含黏合劑而含有熒光劑）等。同樣，氧化鋁也分為氧化鋁G、氧化鋁H和氧化鋁HF254等。
極性較強(qiáng)的組分選擇極性較強(qiáng)的展開劑，極性較弱的組分選擇極性較弱的展開劑。展開劑的選擇要使組分的Rf值在0.3～0.5范圍內(nèi)為宜。
（2）薄層板的制備。將1份固定相和3份水在研缽中研磨，均勻涂于玻璃板上，室溫晾干后于110℃加熱30分鐘，置干燥器中備用。
（3）點(diǎn)樣與展開。用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣于薄層板上，一般為圓點(diǎn)，點(diǎn)樣基線距底2.0cm，樣點(diǎn)直徑以2～4mm為宜，點(diǎn)間距離為1.5～2.0cm，點(diǎn)樣時(shí)勿損傷薄層表面。將點(diǎn)好樣品的薄層板放入層析缸的展開劑中，浸入展開劑的深度為距薄層底邊0.5～1.0cm（切勿將樣品浸入展開劑中），密封室蓋，待展開至規(guī)定距離（一般為10～15cm）后，取出薄層板，標(biāo)記好前沿，晾干。
薄層色譜的展開方式多為上行法，還有下行展開、雙向展開、多次展開等多種方式。
（4）斑點(diǎn)的定位。進(jìn)行定性或定量前都必須確定組分在薄層板上的位置，即定位。定位的方式有直接目視法、顯色法、紫外燈下觀察熒光法、熒光淬滅法等。
3．應(yīng)用
（1）鑒別。比較供試液與對(duì)照液的比移值。將兩種溶液點(diǎn)于同一薄層板上，展開后比較兩者的Rf，應(yīng)一致。
（2）雜質(zhì)檢查
①雜質(zhì)對(duì)照品比較法。配制一定濃度的供試品溶液和規(guī)定限度濃度的雜質(zhì)對(duì)照品溶液，點(diǎn)樣、展開、檢測(cè)后比較，供試品中相應(yīng)雜質(zhì)斑點(diǎn)的顏色應(yīng)不深于雜質(zhì)對(duì)照品的斑點(diǎn)顏色。
②高低濃度對(duì)比法（主成分自身對(duì)照法）。先配制一定濃度的供試品溶液，然后稀釋一定倍數(shù)得到另一低濃度溶液，作為對(duì)照溶液。將兩種溶液點(diǎn)樣，展開后，比較所得斑點(diǎn)。供試品溶液中雜質(zhì)斑點(diǎn)的顏色不得深于對(duì)照溶液的主斑點(diǎn)（有的還規(guī)定供試品溶液雜質(zhì)斑點(diǎn)個(gè)數(shù)不得超過幾個(gè)）。
③檢測(cè)限法。配制一定濃度的供試品溶液，點(diǎn)樣、展開后，檢查。要求供試品溶液中不得出現(xiàn)雜質(zhì)斑點(diǎn)。