分光光度法
☆ ☆☆☆☆考點(diǎn)1：紫外-可見(jiàn)分光光度法
1．基本概念
（1）分光光度法：測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)光的吸收度，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析的方法稱為分光光度法。
（2）紫外光：波長(zhǎng)在200～400nm范圍內(nèi)的光稱為紫外光。
（3）可見(jiàn)光：波長(zhǎng)在400～760nm范圍內(nèi)的光稱為可見(jiàn)光。
（4）紫外-可見(jiàn)吸收光譜：物質(zhì)吸收紫外線和可見(jiàn)光區(qū)的電磁波而產(chǎn)生的吸收光譜稱為紫外-可見(jiàn)吸收光譜。
（5）紫外-可見(jiàn)分光光度法（UV）：利用紫外-可見(jiàn)吸收光譜進(jìn)行定性和定量分析的方法，稱為紫外-可見(jiàn)分光光度法。
紫外-可見(jiàn)分光光度法可用于藥物的鑒別、檢查和含量測(cè)定，是藥品檢驗(yàn)中應(yīng)用非常廣泛的一類儀器分析方法?！吨袊?guó)藥典》附錄收載有紫外分光光度法。
2．基本原理
（1）紫外-可見(jiàn)光譜的性質(zhì)：分子的價(jià)電子吸收了光的能量，由低能量的基態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芰康募ぐl(fā)態(tài)的過(guò)程稱為躍遷。被測(cè)物分子的價(jià)電子吸收紫外光或可見(jiàn)光，從低能級(jí)躍遷到高能級(jí)，產(chǎn)生吸收光譜。
（2）紫外-可見(jiàn)分光光度法的分析步驟：供試品制成溶液，放入比色皿中，置于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，繪得吸收?qǐng)D譜。
（3）定性依據(jù)：被測(cè)物的結(jié)構(gòu)不同，其電子躍遷方式不同，則產(chǎn)生不同的吸收光譜。根據(jù)圖譜中的峰位（即吸收波長(zhǎng)λmax）、谷位（即最小吸收波長(zhǎng)λmin）、吸收波長(zhǎng)處的吸收系數(shù)（即E1%1cmλmax）、有無(wú)肩峰、特定波長(zhǎng)處的吸收度比值等，可以對(duì)被測(cè)物進(jìn)行定性。
（4）定量依據(jù)--Lambert-Beer定律：A=-lgT=-lg(I/I0)=ECL
式中，A為供試液的吸收度；T為透光率；E為被測(cè)物的吸收系數(shù)；C為供試液濃度；L為液層厚度；I0為入射光強(qiáng)度；I為透射光強(qiáng)度。
（5）吸收系數(shù)：是物質(zhì)的特性常數(shù)。分為百分吸收系數(shù)E1%1cm和摩爾吸收系數(shù)ε。
3．紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)
（1）基本組成：光源→單色器→吸收池→檢測(cè)器→數(shù)據(jù)記錄和處理。
（2）光源：紫外光區(qū)通常采用氫燈或氘燈，可見(jiàn)光區(qū)采用鎢燈或鹵鎢燈。
（3）單色器：由色散元件（棱鏡或光柵）和狹縫（過(guò)寬，光強(qiáng)小，檢測(cè)靈敏度降低）組成。
（4）吸收池（比色皿）：紫外光測(cè)定用石英吸收池；可見(jiàn)光測(cè)定用玻璃吸收池。
（5）檢測(cè)器：常用光電池、光電管、光電倍增管、光二極管陣列檢測(cè)器。
4．儀器的校正和檢定
（1）目的：保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
（2）規(guī)定：定期對(duì)儀器進(jìn)行全面校正檢定外，還應(yīng)于測(cè)定前對(duì)波長(zhǎng)進(jìn)行校正（采用汞燈或氘燈的特征譜線）；吸收度的準(zhǔn)確性采用重鉻酸鉀的硫酸溶液來(lái)檢定；雜散光則采用碘化鈉和亞硝酸鈉溶液進(jìn)行檢查。
5．紫外-可見(jiàn)吸收光譜與物質(zhì)結(jié)構(gòu)的關(guān)系
不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)具有不同的電子能級(jí)，其價(jià)電子由基態(tài)向激發(fā)態(tài)躍遷時(shí)吸收的光能不同，在光譜圖的不同波長(zhǎng)處產(chǎn)生吸收峰。
（1）σ→σ*躍遷：處于σ成鍵軌道上的電子吸收光能后躍遷到σ*反鍵軌道，產(chǎn)生的吸收峰在遠(yuǎn)紫外區(qū)，λmax＜200nm（通常測(cè)不出）。
（2）π→π*躍遷：處于π成鍵軌道上的電子躍遷到π*反鍵軌道上。孤立π鍵的λmax=200nm（強(qiáng)吸收）；共軛者的λmax＞210nm。共軛體系越長(zhǎng)，躍遷所需的能量越小，吸收峰的波長(zhǎng)也越長(zhǎng)。
（3）n→π*躍遷：含有雜原子（O、S、N）的不飽和基團(tuán)（如C=O、C=S、-N=N-）的價(jià)電子躍遷。λmax=200～400nm（弱吸收）。
（4）n→σ*躍遷：含-OH、-NH2、-X、-S等基團(tuán)的化合物中介電子的躍遷。λmax=200（弱→中等強(qiáng)度的吸收）。
在藥物分析中應(yīng)用最多的是共軛體系的π→π*躍遷產(chǎn)生的吸收，n→π*躍遷的吸收有時(shí)也可應(yīng)用。
6．吸收度的測(cè)定方法
（1）對(duì)溶劑的要求。充分溶解樣品、不與樣品作用、揮發(fā)性小、在測(cè)定波長(zhǎng)處無(wú)干擾（透明）。以空氣為空白，溶劑吸收度在220～240nm范圍內(nèi)不得超過(guò)0.40，在241～250nm范圍內(nèi)不得超過(guò)0.20，在251～300nm范圍內(nèi)不得超過(guò)0.10，在300nm以上不得超過(guò)0.05。
（2）空白對(duì)照試驗(yàn)。用溶劑調(diào)節(jié)儀器，使吸收度為0或透光率為100%，然后測(cè)定樣品池的吸收，此時(shí)的吸收即為供試品的吸收。
（3）測(cè)定波長(zhǎng)確證。采用1cm的石英吸收池，核對(duì)供試品吸收峰的位置，應(yīng)在規(guī)定吸收峰波長(zhǎng)±2nm以內(nèi)。
（4）供試品溶液的濃度。使用吸收度在0.3～0.7范圍內(nèi)所對(duì)應(yīng)的供試品溶液的濃度。
（5）儀器的狹縫寬度。過(guò)大，光純度變差，則A降低；應(yīng)以減少狹縫寬度，A不再增加為準(zhǔn)。
7．應(yīng)用
（1）鑒別。同一物質(zhì)的UV譜應(yīng)該相同，但是，相同的UV光譜不一定代表同一物質(zhì)。為了提高UV光譜的專屬性，《中國(guó)藥典》采用下列方式：①對(duì)比光譜的特征參數(shù)：λmax、λmin、E1%1cm、A、肩峰、吸收谷。②對(duì)比吸收度比值的一致性。③對(duì)比吸收光譜的一致性。
（2）雜質(zhì)檢查。利用藥物和雜質(zhì)的吸收光譜有明顯差別進(jìn)行檢查。若藥物無(wú)吸收，雜質(zhì)有吸收，可通過(guò)控制其吸收度不得超過(guò)規(guī)定值控制雜質(zhì)限量；若藥物有吸收，雜質(zhì)吸收很弱或沒(méi)有吸收，也可以通過(guò)控制其吸收度控制雜質(zhì)限量。
（3）含量測(cè)定。
①對(duì)照品比較法。在相同的條件下分別測(cè)定供試液（CX）和對(duì)照液（CR）的吸收度AX和AR，按下式計(jì)算含量：CX=（AX/AR）CR
②吸收系數(shù)法。在規(guī)定波長(zhǎng)處測(cè)定供試液的吸收度，依被測(cè)組分的吸收系數(shù)計(jì)算含量。
使用吸收系數(shù)法測(cè)定時(shí)，對(duì)儀器須進(jìn)行嚴(yán)格的校正和檢定，如波長(zhǎng)的準(zhǔn)確度、狹縫寬度等必須符合要求，以保證吸收度測(cè)定的準(zhǔn)確性。
③計(jì)算分光光度法。將測(cè)得的吸收度進(jìn)行適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)處理，求得待測(cè)組分的含量。例如，雙波長(zhǎng)分光光度法、導(dǎo)數(shù)光譜法等。主要用于消除樣品中干擾組分的干擾。
④工作曲線法。配制系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制工作曲線，從中查得供試液含量。
☆ ☆☆☆☆考點(diǎn)1：紫外-可見(jiàn)分光光度法
1．基本概念
（1）分光光度法：測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)光的吸收度，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析的方法稱為分光光度法。
（2）紫外光：波長(zhǎng)在200～400nm范圍內(nèi)的光稱為紫外光。
（3）可見(jiàn)光：波長(zhǎng)在400～760nm范圍內(nèi)的光稱為可見(jiàn)光。
（4）紫外-可見(jiàn)吸收光譜：物質(zhì)吸收紫外線和可見(jiàn)光區(qū)的電磁波而產(chǎn)生的吸收光譜稱為紫外-可見(jiàn)吸收光譜。
（5）紫外-可見(jiàn)分光光度法（UV）：利用紫外-可見(jiàn)吸收光譜進(jìn)行定性和定量分析的方法，稱為紫外-可見(jiàn)分光光度法。
紫外-可見(jiàn)分光光度法可用于藥物的鑒別、檢查和含量測(cè)定，是藥品檢驗(yàn)中應(yīng)用非常廣泛的一類儀器分析方法?！吨袊?guó)藥典》附錄收載有紫外分光光度法。
2．基本原理
（1）紫外-可見(jiàn)光譜的性質(zhì)：分子的價(jià)電子吸收了光的能量，由低能量的基態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芰康募ぐl(fā)態(tài)的過(guò)程稱為躍遷。被測(cè)物分子的價(jià)電子吸收紫外光或可見(jiàn)光，從低能級(jí)躍遷到高能級(jí)，產(chǎn)生吸收光譜。
（2）紫外-可見(jiàn)分光光度法的分析步驟：供試品制成溶液，放入比色皿中，置于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，繪得吸收?qǐng)D譜。
（3）定性依據(jù)：被測(cè)物的結(jié)構(gòu)不同，其電子躍遷方式不同，則產(chǎn)生不同的吸收光譜。根據(jù)圖譜中的峰位（即吸收波長(zhǎng)λmax）、谷位（即最小吸收波長(zhǎng)λmin）、吸收波長(zhǎng)處的吸收系數(shù)（即E1%1cmλmax）、有無(wú)肩峰、特定波長(zhǎng)處的吸收度比值等，可以對(duì)被測(cè)物進(jìn)行定性。
（4）定量依據(jù)--Lambert-Beer定律：A=-lgT=-lg(I/I0)=ECL
式中，A為供試液的吸收度；T為透光率；E為被測(cè)物的吸收系數(shù)；C為供試液濃度；L為液層厚度；I0為入射光強(qiáng)度；I為透射光強(qiáng)度。
（5）吸收系數(shù)：是物質(zhì)的特性常數(shù)。分為百分吸收系數(shù)E1%1cm和摩爾吸收系數(shù)ε。
3．紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)
（1）基本組成：光源→單色器→吸收池→檢測(cè)器→數(shù)據(jù)記錄和處理。
（2）光源：紫外光區(qū)通常采用氫燈或氘燈，可見(jiàn)光區(qū)采用鎢燈或鹵鎢燈。
（3）單色器：由色散元件（棱鏡或光柵）和狹縫（過(guò)寬，光強(qiáng)小，檢測(cè)靈敏度降低）組成。
（4）吸收池（比色皿）：紫外光測(cè)定用石英吸收池；可見(jiàn)光測(cè)定用玻璃吸收池。
（5）檢測(cè)器：常用光電池、光電管、光電倍增管、光二極管陣列檢測(cè)器。
4．儀器的校正和檢定
（1）目的：保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
（2）規(guī)定：定期對(duì)儀器進(jìn)行全面校正檢定外，還應(yīng)于測(cè)定前對(duì)波長(zhǎng)進(jìn)行校正（采用汞燈或氘燈的特征譜線）；吸收度的準(zhǔn)確性采用重鉻酸鉀的硫酸溶液來(lái)檢定；雜散光則采用碘化鈉和亞硝酸鈉溶液進(jìn)行檢查。
5．紫外-可見(jiàn)吸收光譜與物質(zhì)結(jié)構(gòu)的關(guān)系
不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)具有不同的電子能級(jí)，其價(jià)電子由基態(tài)向激發(fā)態(tài)躍遷時(shí)吸收的光能不同，在光譜圖的不同波長(zhǎng)處產(chǎn)生吸收峰。
（1）σ→σ*躍遷：處于σ成鍵軌道上的電子吸收光能后躍遷到σ*反鍵軌道，產(chǎn)生的吸收峰在遠(yuǎn)紫外區(qū)，λmax＜200nm（通常測(cè)不出）。
（2）π→π*躍遷：處于π成鍵軌道上的電子躍遷到π*反鍵軌道上。孤立π鍵的λmax=200nm（強(qiáng)吸收）；共軛者的λmax＞210nm。共軛體系越長(zhǎng)，躍遷所需的能量越小，吸收峰的波長(zhǎng)也越長(zhǎng)。
（3）n→π*躍遷：含有雜原子（O、S、N）的不飽和基團(tuán)（如C=O、C=S、-N=N-）的價(jià)電子躍遷。λmax=200～400nm（弱吸收）。
（4）n→σ*躍遷：含-OH、-NH2、-X、-S等基團(tuán)的化合物中介電子的躍遷。λmax=200（弱→中等強(qiáng)度的吸收）。
在藥物分析中應(yīng)用最多的是共軛體系的π→π*躍遷產(chǎn)生的吸收，n→π*躍遷的吸收有時(shí)也可應(yīng)用。
6．吸收度的測(cè)定方法
（1）對(duì)溶劑的要求。充分溶解樣品、不與樣品作用、揮發(fā)性小、在測(cè)定波長(zhǎng)處無(wú)干擾（透明）。以空氣為空白，溶劑吸收度在220～240nm范圍內(nèi)不得超過(guò)0.40，在241～250nm范圍內(nèi)不得超過(guò)0.20，在251～300nm范圍內(nèi)不得超過(guò)0.10，在300nm以上不得超過(guò)0.05。
（2）空白對(duì)照試驗(yàn)。用溶劑調(diào)節(jié)儀器，使吸收度為0或透光率為100%，然后測(cè)定樣品池的吸收，此時(shí)的吸收即為供試品的吸收。
（3）測(cè)定波長(zhǎng)確證。采用1cm的石英吸收池，核對(duì)供試品吸收峰的位置，應(yīng)在規(guī)定吸收峰波長(zhǎng)±2nm以內(nèi)。
（4）供試品溶液的濃度。使用吸收度在0.3～0.7范圍內(nèi)所對(duì)應(yīng)的供試品溶液的濃度。
（5）儀器的狹縫寬度。過(guò)大，光純度變差，則A降低；應(yīng)以減少狹縫寬度，A不再增加為準(zhǔn)。
7．應(yīng)用
（1）鑒別。同一物質(zhì)的UV譜應(yīng)該相同，但是，相同的UV光譜不一定代表同一物質(zhì)。為了提高UV光譜的專屬性，《中國(guó)藥典》采用下列方式：①對(duì)比光譜的特征參數(shù)：λmax、λmin、E1%1cm、A、肩峰、吸收谷。②對(duì)比吸收度比值的一致性。③對(duì)比吸收光譜的一致性。
（2）雜質(zhì)檢查。利用藥物和雜質(zhì)的吸收光譜有明顯差別進(jìn)行檢查。若藥物無(wú)吸收，雜質(zhì)有吸收，可通過(guò)控制其吸收度不得超過(guò)規(guī)定值控制雜質(zhì)限量；若藥物有吸收，雜質(zhì)吸收很弱或沒(méi)有吸收，也可以通過(guò)控制其吸收度控制雜質(zhì)限量。
（3）含量測(cè)定。
①對(duì)照品比較法。在相同的條件下分別測(cè)定供試液（CX）和對(duì)照液（CR）的吸收度AX和AR，按下式計(jì)算含量：CX=（AX/AR）CR
②吸收系數(shù)法。在規(guī)定波長(zhǎng)處測(cè)定供試液的吸收度，依被測(cè)組分的吸收系數(shù)計(jì)算含量。
使用吸收系數(shù)法測(cè)定時(shí)，對(duì)儀器須進(jìn)行嚴(yán)格的校正和檢定，如波長(zhǎng)的準(zhǔn)確度、狹縫寬度等必須符合要求，以保證吸收度測(cè)定的準(zhǔn)確性。
③計(jì)算分光光度法。將測(cè)得的吸收度進(jìn)行適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)處理，求得待測(cè)組分的含量。例如，雙波長(zhǎng)分光光度法、導(dǎo)數(shù)光譜法等。主要用于消除樣品中干擾組分的干擾。
④工作曲線法。配制系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制工作曲線，從中查得供試液含量。