分光光度法
☆ ☆☆☆☆考點1：紫外-可見分光光度法
1．基本概念
（1）分光光度法：測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)對光的吸收度，對物質(zhì)進行定性、定量分析的方法稱為分光光度法。
（2）紫外光：波長在200～400nm范圍內(nèi)的光稱為紫外光。
（3）可見光：波長在400～760nm范圍內(nèi)的光稱為可見光。
（4）紫外-可見吸收光譜：物質(zhì)吸收紫外線和可見光區(qū)的電磁波而產(chǎn)生的吸收光譜稱為紫外-可見吸收光譜。
（5）紫外-可見分光光度法（UV）：利用紫外-可見吸收光譜進行定性和定量分析的方法，稱為紫外-可見分光光度法。
紫外-可見分光光度法可用于藥物的鑒別、檢查和含量測定，是藥品檢驗中應(yīng)用非常廣泛的一類儀器分析方法?！吨袊幍洹犯戒浭蛰d有紫外分光光度法。
2．基本原理
（1）紫外-可見光譜的性質(zhì)：分子的價電子吸收了光的能量，由低能量的基態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芰康募ぐl(fā)態(tài)的過程稱為躍遷。被測物分子的價電子吸收紫外光或可見光，從低能級躍遷到高能級，產(chǎn)生吸收光譜。
（2）紫外-可見分光光度法的分析步驟：供試品制成溶液，放入比色皿中，置于紫外-可見分光光度計，繪得吸收圖譜。
（3）定性依據(jù)：被測物的結(jié)構(gòu)不同，其電子躍遷方式不同，則產(chǎn)生不同的吸收光譜。根據(jù)圖譜中的峰位（即吸收波長λmax）、谷位（即最小吸收波長λmin）、吸收波長處的吸收系數(shù)（即E1%1cmλmax）、有無肩峰、特定波長處的吸收度比值等，可以對被測物進行定性。
（4）定量依據(jù)--Lambert-Beer定律：A=-lgT=-lg(I/I0)=ECL
式中，A為供試液的吸收度；T為透光率；E為被測物的吸收系數(shù)；C為供試液濃度；L為液層厚度；I0為入射光強度；I為透射光強度。
（5）吸收系數(shù)：是物質(zhì)的特性常數(shù)。分為百分吸收系數(shù)E1%1cm和摩爾吸收系數(shù)ε。
3．紫外-可見分光光度計
（1）基本組成：光源→單色器→吸收池→檢測器→數(shù)據(jù)記錄和處理。
（2）光源：紫外光區(qū)通常采用氫燈或氘燈，可見光區(qū)采用鎢燈或鹵鎢燈。
（3）單色器：由色散元件（棱鏡或光柵）和狹縫（過寬，光強小，檢測靈敏度降低）組成。
（4）吸收池（比色皿）：紫外光測定用石英吸收池；可見光測定用玻璃吸收池。
（5）檢測器：常用光電池、光電管、光電倍增管、光二極管陣列檢測器。
4．儀器的校正和檢定
（1）目的：保證測定結(jié)果的準確性。
（2）規(guī)定：定期對儀器進行全面校正檢定外，還應(yīng)于測定前對波長進行校正（采用汞燈或氘燈的特征譜線）；吸收度的準確性采用重鉻酸鉀的硫酸溶液來檢定；雜散光則采用碘化鈉和亞硝酸鈉溶液進行檢查。
5．紫外-可見吸收光譜與物質(zhì)結(jié)構(gòu)的關(guān)系
不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)具有不同的電子能級，其價電子由基態(tài)向激發(fā)態(tài)躍遷時吸收的光能不同，在光譜圖的不同波長處產(chǎn)生吸收峰。
（1）σ→σ*躍遷：處于σ成鍵軌道上的電子吸收光能后躍遷到σ*反鍵軌道，產(chǎn)生的吸收峰在遠紫外區(qū)，λmax＜200nm（通常測不出）。
（2）π→π*躍遷：處于π成鍵軌道上的電子躍遷到π*反鍵軌道上。孤立π鍵的λmax=200nm（強吸收）；共軛者的λmax＞210nm。共軛體系越長，躍遷所需的能量越小，吸收峰的波長也越長。
（3）n→π*躍遷：含有雜原子（O、S、N）的不飽和基團（如C=O、C=S、-N=N-）的價電子躍遷。λmax=200～400nm（弱吸收）。
（4）n→σ*躍遷：含-OH、-NH2、-X、-S等基團的化合物中介電子的躍遷。λmax=200（弱→中等強度的吸收）。
在藥物分析中應(yīng)用最多的是共軛體系的π→π*躍遷產(chǎn)生的吸收，n→π*躍遷的吸收有時也可應(yīng)用。
6．吸收度的測定方法
（1）對溶劑的要求。充分溶解樣品、不與樣品作用、揮發(fā)性小、在測定波長處無干擾（透明）。以空氣為空白，溶劑吸收度在220～240nm范圍內(nèi)不得超過0.40，在241～250nm范圍內(nèi)不得超過0.20，在251～300nm范圍內(nèi)不得超過0.10，在300nm以上不得超過0.05。
（2）空白對照試驗。用溶劑調(diào)節(jié)儀器，使吸收度為0或透光率為100%，然后測定樣品池的吸收，此時的吸收即為供試品的吸收。
（3）測定波長確證。采用1cm的石英吸收池，核對供試品吸收峰的位置，應(yīng)在規(guī)定吸收峰波長±2nm以內(nèi)。
（4）供試品溶液的濃度。使用吸收度在0.3～0.7范圍內(nèi)所對應(yīng)的供試品溶液的濃度。
（5）儀器的狹縫寬度。過大，光純度變差，則A降低；應(yīng)以減少狹縫寬度，A不再增加為準。
7．應(yīng)用
（1）鑒別。同一物質(zhì)的UV譜應(yīng)該相同，但是，相同的UV光譜不一定代表同一物質(zhì)。為了提高UV光譜的專屬性，《中國藥典》采用下列方式：①對比光譜的特征參數(shù)：λmax、λmin、E1%1cm、A、肩峰、吸收谷。②對比吸收度比值的一致性。③對比吸收光譜的一致性。
（2）雜質(zhì)檢查。利用藥物和雜質(zhì)的吸收光譜有明顯差別進行檢查。若藥物無吸收，雜質(zhì)有吸收，可通過控制其吸收度不得超過規(guī)定值控制雜質(zhì)限量；若藥物有吸收，雜質(zhì)吸收很弱或沒有吸收，也可以通過控制其吸收度控制雜質(zhì)限量。
（3）含量測定。
①對照品比較法。在相同的條件下分別測定供試液（CX）和對照液（CR）的吸收度AX和AR，按下式計算含量：CX=（AX/AR）CR
②吸收系數(shù)法。在規(guī)定波長處測定供試液的吸收度，依被測組分的吸收系數(shù)計算含量。
使用吸收系數(shù)法測定時，對儀器須進行嚴格的校正和檢定，如波長的準確度、狹縫寬度等必須符合要求，以保證吸收度測定的準確性。
③計算分光光度法。將測得的吸收度進行適當?shù)臄?shù)學(xué)處理，求得待測組分的含量。例如，雙波長分光光度法、導(dǎo)數(shù)光譜法等。主要用于消除樣品中干擾組分的干擾。
④工作曲線法。配制系列的標準溶液，繪制工作曲線，從中查得供試液含量。
☆ ☆☆☆☆考點1：紫外-可見分光光度法
1．基本概念
（1）分光光度法：測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)對光的吸收度，對物質(zhì)進行定性、定量分析的方法稱為分光光度法。
（2）紫外光：波長在200～400nm范圍內(nèi)的光稱為紫外光。
（3）可見光：波長在400～760nm范圍內(nèi)的光稱為可見光。
（4）紫外-可見吸收光譜：物質(zhì)吸收紫外線和可見光區(qū)的電磁波而產(chǎn)生的吸收光譜稱為紫外-可見吸收光譜。
（5）紫外-可見分光光度法（UV）：利用紫外-可見吸收光譜進行定性和定量分析的方法，稱為紫外-可見分光光度法。
紫外-可見分光光度法可用于藥物的鑒別、檢查和含量測定，是藥品檢驗中應(yīng)用非常廣泛的一類儀器分析方法?！吨袊幍洹犯戒浭蛰d有紫外分光光度法。
2．基本原理
（1）紫外-可見光譜的性質(zhì)：分子的價電子吸收了光的能量，由低能量的基態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芰康募ぐl(fā)態(tài)的過程稱為躍遷。被測物分子的價電子吸收紫外光或可見光，從低能級躍遷到高能級，產(chǎn)生吸收光譜。
（2）紫外-可見分光光度法的分析步驟：供試品制成溶液，放入比色皿中，置于紫外-可見分光光度計，繪得吸收圖譜。
（3）定性依據(jù)：被測物的結(jié)構(gòu)不同，其電子躍遷方式不同，則產(chǎn)生不同的吸收光譜。根據(jù)圖譜中的峰位（即吸收波長λmax）、谷位（即最小吸收波長λmin）、吸收波長處的吸收系數(shù)（即E1%1cmλmax）、有無肩峰、特定波長處的吸收度比值等，可以對被測物進行定性。
（4）定量依據(jù)--Lambert-Beer定律：A=-lgT=-lg(I/I0)=ECL
式中，A為供試液的吸收度；T為透光率；E為被測物的吸收系數(shù)；C為供試液濃度；L為液層厚度；I0為入射光強度；I為透射光強度。
（5）吸收系數(shù)：是物質(zhì)的特性常數(shù)。分為百分吸收系數(shù)E1%1cm和摩爾吸收系數(shù)ε。
3．紫外-可見分光光度計
（1）基本組成：光源→單色器→吸收池→檢測器→數(shù)據(jù)記錄和處理。
（2）光源：紫外光區(qū)通常采用氫燈或氘燈，可見光區(qū)采用鎢燈或鹵鎢燈。
（3）單色器：由色散元件（棱鏡或光柵）和狹縫（過寬，光強小，檢測靈敏度降低）組成。
（4）吸收池（比色皿）：紫外光測定用石英吸收池；可見光測定用玻璃吸收池。
（5）檢測器：常用光電池、光電管、光電倍增管、光二極管陣列檢測器。
4．儀器的校正和檢定
（1）目的：保證測定結(jié)果的準確性。
（2）規(guī)定：定期對儀器進行全面校正檢定外，還應(yīng)于測定前對波長進行校正（采用汞燈或氘燈的特征譜線）；吸收度的準確性采用重鉻酸鉀的硫酸溶液來檢定；雜散光則采用碘化鈉和亞硝酸鈉溶液進行檢查。
5．紫外-可見吸收光譜與物質(zhì)結(jié)構(gòu)的關(guān)系
不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)具有不同的電子能級，其價電子由基態(tài)向激發(fā)態(tài)躍遷時吸收的光能不同，在光譜圖的不同波長處產(chǎn)生吸收峰。
（1）σ→σ*躍遷：處于σ成鍵軌道上的電子吸收光能后躍遷到σ*反鍵軌道，產(chǎn)生的吸收峰在遠紫外區(qū)，λmax＜200nm（通常測不出）。
（2）π→π*躍遷：處于π成鍵軌道上的電子躍遷到π*反鍵軌道上。孤立π鍵的λmax=200nm（強吸收）；共軛者的λmax＞210nm。共軛體系越長，躍遷所需的能量越小，吸收峰的波長也越長。
（3）n→π*躍遷：含有雜原子（O、S、N）的不飽和基團（如C=O、C=S、-N=N-）的價電子躍遷。λmax=200～400nm（弱吸收）。
（4）n→σ*躍遷：含-OH、-NH2、-X、-S等基團的化合物中介電子的躍遷。λmax=200（弱→中等強度的吸收）。
在藥物分析中應(yīng)用最多的是共軛體系的π→π*躍遷產(chǎn)生的吸收，n→π*躍遷的吸收有時也可應(yīng)用。
6．吸收度的測定方法
（1）對溶劑的要求。充分溶解樣品、不與樣品作用、揮發(fā)性小、在測定波長處無干擾（透明）。以空氣為空白，溶劑吸收度在220～240nm范圍內(nèi)不得超過0.40，在241～250nm范圍內(nèi)不得超過0.20，在251～300nm范圍內(nèi)不得超過0.10，在300nm以上不得超過0.05。
（2）空白對照試驗。用溶劑調(diào)節(jié)儀器，使吸收度為0或透光率為100%，然后測定樣品池的吸收，此時的吸收即為供試品的吸收。
（3）測定波長確證。采用1cm的石英吸收池，核對供試品吸收峰的位置，應(yīng)在規(guī)定吸收峰波長±2nm以內(nèi)。
（4）供試品溶液的濃度。使用吸收度在0.3～0.7范圍內(nèi)所對應(yīng)的供試品溶液的濃度。
（5）儀器的狹縫寬度。過大，光純度變差，則A降低；應(yīng)以減少狹縫寬度，A不再增加為準。
7．應(yīng)用
（1）鑒別。同一物質(zhì)的UV譜應(yīng)該相同，但是，相同的UV光譜不一定代表同一物質(zhì)。為了提高UV光譜的專屬性，《中國藥典》采用下列方式：①對比光譜的特征參數(shù)：λmax、λmin、E1%1cm、A、肩峰、吸收谷。②對比吸收度比值的一致性。③對比吸收光譜的一致性。
（2）雜質(zhì)檢查。利用藥物和雜質(zhì)的吸收光譜有明顯差別進行檢查。若藥物無吸收，雜質(zhì)有吸收，可通過控制其吸收度不得超過規(guī)定值控制雜質(zhì)限量；若藥物有吸收，雜質(zhì)吸收很弱或沒有吸收，也可以通過控制其吸收度控制雜質(zhì)限量。
（3）含量測定。
①對照品比較法。在相同的條件下分別測定供試液（CX）和對照液（CR）的吸收度AX和AR，按下式計算含量：CX=（AX/AR）CR
②吸收系數(shù)法。在規(guī)定波長處測定供試液的吸收度，依被測組分的吸收系數(shù)計算含量。
使用吸收系數(shù)法測定時，對儀器須進行嚴格的校正和檢定，如波長的準確度、狹縫寬度等必須符合要求，以保證吸收度測定的準確性。
③計算分光光度法。將測得的吸收度進行適當?shù)臄?shù)學(xué)處理，求得待測組分的含量。例如，雙波長分光光度法、導(dǎo)數(shù)光譜法等。主要用于消除樣品中干擾組分的干擾。
④工作曲線法。配制系列的標準溶液，繪制工作曲線，從中查得供試液含量。