抗生素類藥物的分析
☆ ☆☆☆考點(diǎn)1：青霉素鈉的分析
1．結(jié)構(gòu)及性質(zhì)
青霉素鈉屬β-內(nèi)酰胺類抗生素。其結(jié)構(gòu)如下：
青霉素類藥物的結(jié)構(gòu)由母核和側(cè)鏈兩部分組成。母核為6-氨基青霉烷酸，由β-內(nèi)酰胺環(huán)和氫化的噻唑環(huán)并合而成，C3上有一個(gè)羧基。不同的側(cè)鏈構(gòu)成不同的藥物。青霉素鈉的側(cè)鏈為一芐基，母核上的羧基成鈉鹽，以增加藥物水溶性。
青霉素鈉的側(cè)鏈上有苯環(huán)，所以有紫外吸收。青霉素鈉結(jié)構(gòu)中的β-內(nèi)酰胺環(huán)不穩(wěn)定，與酸、堿、青霉素酶及某些金屬離子作用時(shí)，易水解開環(huán)，并發(fā)生分子重排，使藥物的活性降低。本類藥物的分析方法，有的正是利用分解產(chǎn)物來進(jìn)行的。本類藥物在堿性條件或青霉素酶的作用下，β-內(nèi)酰胺開環(huán)形成青霉噻唑酸，在pH4的酸性條件下可開環(huán)、重排成青霉烯酸，其降解的最終產(chǎn)物為青霉醛和青霉胺。
2．鑒別
（1）抑菌試驗(yàn)。通過對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用進(jìn)行鑒別。
鑒別方法：取本品與已知含量的青霉素適量，分別加水制成每1ml中約含50μg的溶液，各取1ml，加入不少于200單位的青霉素酶溶液1ml，在37℃滅活1小時(shí)后，取滅菌濾紙片，分別用上述溶液浸濕后，用濾紙吸去多余的液體，置攤布金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)約16小時(shí)后均無抑菌作用，而用同一方法檢查未經(jīng)青霉素酶滅活的溶液均有抑菌作用。
（2）沉淀反應(yīng)。根據(jù)本品的鹽和分子型溶解行為的差異進(jìn)行鑒別。
鑒別方法：取本品約0.1g，加水5ml溶解后，加稀鹽酸2滴，即生成白色沉淀；此沉淀能在乙醇、醋酸戊酯、氯仿、乙醚或過量的鹽酸中溶解。
本品為鈉鹽，易溶于水，加鹽酸2滴使成酸性后，轉(zhuǎn)化為分子型，難溶于水，即生成白色沉淀。此沉淀能溶解于有機(jī)溶劑中。在過量的鹽酸中，酰胺基成鹽，水溶性增大而溶解。
（3）紅外光譜法 《中國藥典》采用紅外光譜法鑒別本品，用溴化鉀壓片，主要特征峰如下表：
《中國藥典》規(guī)定，本品的紅外吸收光譜應(yīng)與對(duì)照品的圖譜一致。
（4）鈉鹽的火焰反應(yīng)。本品為鈉鹽，照《中國藥典》附錄“一般鑒別試驗(yàn)”中鈉鹽的火焰反應(yīng)方法試驗(yàn)。取鉑絲，用鹽酸濕潤后，蘸取供試品，在無色火焰中燃燒，火焰即顯鮮黃色。
3．檢查
（1）吸收度。青霉素鈉側(cè)鏈的苯環(huán)有紫外吸收，其水溶液在264nm的波長處有吸收，而降解產(chǎn)物在280nm處有吸收。取本品，加水制成每1ml中含1.80mg的溶液，照分光光度法，在280nm的波長處測(cè)定吸收度，不得大于0.10；在264nm的波長處有吸收，吸收度應(yīng)為0.80～0.88。
測(cè)定264nm處的吸收度是為了控制青霉素鈉的含量，規(guī)定280nm處的吸收度不得超過0.10，則是為了控制雜質(zhì)的量。
（2）水分。本品遇水易水解而失效，所以應(yīng)嚴(yán)格控制水分的含量?！吨袊幍洹芬?guī)定，用水分測(cè)定法（費(fèi)休法）測(cè)定，含水分不得超過0.5%。
（3）細(xì)菌內(nèi)毒素。本品由微生物發(fā)酵制得，易引入細(xì)菌內(nèi)毒素，《中國藥典》規(guī)定，照附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”檢查，每100單位青霉素中含細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)小于0.01EU。
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)的機(jī)理，來判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素是否符合規(guī)定的方法。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位（EU）來表示。
（4）無菌。取本品，用青霉素酶滅活后，按《中國藥典》附錄“無菌檢查法”檢查，應(yīng)符合規(guī)定。
無菌檢查法是將供試品溶液分別接種于需氧菌、厭氧菌和真菌培養(yǎng)基中，在規(guī)定條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，觀察是否有菌生長，來判斷供試品是否無菌。青霉素本身有抗菌作用，所以先用青霉素酶將其滅活后，再進(jìn)行檢查。
4．含量測(cè)定
《中國藥典》采用汞量法測(cè)定本品的含量。
青霉素分子不與汞鹽反應(yīng)，其堿性水解產(chǎn)物青霉噻唑酸及繼續(xù)水解生成的青霉胺都能與汞鹽定量反應(yīng)，根據(jù)消耗的汞鹽量可以計(jì)算青霉素的含量。
青霉素分子中的氫化噻唑環(huán)含由一個(gè)硫原子，開環(huán)后形成巰基（-SH），利用Hg2+與巰基的反應(yīng)測(cè)定其含量，反應(yīng)為：
Hg2+＋2R－SH→（RS）2Hg＋2H+
測(cè)定方法：取本品約50mg，精密稱定，加水5ml溶解后，加1mol/L氫氧化鈉溶液5ml，搖勻，放置15分鐘，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸鹽緩沖液（pH4.6）20ml及水20ml，搖勻，照電位滴定法，用鉑電極作為指示電極，汞一硫酸亞汞電極為參比電極，在35～40℃用硝酸汞滴定液（0.02mol/L）緩緩滴定，不計(jì)第一個(gè)等當(dāng)點(diǎn)，計(jì)算第二個(gè)等當(dāng)點(diǎn)時(shí)消耗滴定液的量，每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相當(dāng)于7.128mg的總青霉素（按C16H17N2NaO4S計(jì)算）。
另取本品約0.5g，精密稱定，加水與上述醋酸鹽緩沖液各25ml，振搖使完全溶解，在室溫下，立即用硝酸汞滴定液（0.02mol/L）滴定，滴定終點(diǎn)判斷方法同上。每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相當(dāng)于7.128mg降解物（按C16H17N2NaO4S計(jì)算）。
總青霉素的百分含量與降解物的百分含量之差值即為青霉素的含量。
滴定前加1mol/L的氫氧化鈉溶液5ml的目的是使藥物水解為青霉噻唑酸并繼續(xù)水解生成青霉胺，才能與Hg2+反應(yīng)。加堿水解后，加等量的硝酸中和，再加pH4.6的醋酸鹽緩沖液，方能進(jìn)行滴定。
由于Hg2+為+2價(jià)，在滴定曲線上可出現(xiàn)兩個(gè)突躍，計(jì)算時(shí)以第二個(gè)突躍為準(zhǔn)，此時(shí)青霉素鈉與Hg（N03）2反應(yīng)的摩爾比為1：1。
空白試驗(yàn)時(shí)，也要稱取供試品，但不經(jīng)水解直接滴定，目的是消除樣品中降解產(chǎn)物對(duì)測(cè)定的影響。
因?yàn)?mol的Hg（NO3）2相當(dāng)于1mol的青霉素鈉，青霉素鈉的分子量為356.38，所以1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相當(dāng)于7.128mg的青霉素鈉。計(jì)算含量測(cè)定結(jié)果時(shí)，先計(jì)算總青霉素的百分含量：
式中，V--消耗硝酸汞滴定液的體積，ml；C--硝酸汞滴定液的濃度，mol/L；W--樣品的稱樣量，mg。
再按相同的方法計(jì)算降解產(chǎn)物的百分含量。青霉素的百分含量為總青霉素的百分含量與降解產(chǎn)物百分含量之差。
青霉素含量（%）＝總青霉素含量（%）－降解產(chǎn)物含量（%）
5．貯藏
由于青霉紊鈉不穩(wěn)定，《中國藥典》規(guī)定本品的貯藏條件為：嚴(yán)封，在涼暗干燥處保存
☆ ☆☆☆考點(diǎn)1：青霉素鈉的分析
1．結(jié)構(gòu)及性質(zhì)
青霉素鈉屬β-內(nèi)酰胺類抗生素。其結(jié)構(gòu)如下：
青霉素類藥物的結(jié)構(gòu)由母核和側(cè)鏈兩部分組成。母核為6-氨基青霉烷酸，由β-內(nèi)酰胺環(huán)和氫化的噻唑環(huán)并合而成，C3上有一個(gè)羧基。不同的側(cè)鏈構(gòu)成不同的藥物。青霉素鈉的側(cè)鏈為一芐基，母核上的羧基成鈉鹽，以增加藥物水溶性。
青霉素鈉的側(cè)鏈上有苯環(huán)，所以有紫外吸收。青霉素鈉結(jié)構(gòu)中的β-內(nèi)酰胺環(huán)不穩(wěn)定，與酸、堿、青霉素酶及某些金屬離子作用時(shí)，易水解開環(huán)，并發(fā)生分子重排，使藥物的活性降低。本類藥物的分析方法，有的正是利用分解產(chǎn)物來進(jìn)行的。本類藥物在堿性條件或青霉素酶的作用下，β-內(nèi)酰胺開環(huán)形成青霉噻唑酸，在pH4的酸性條件下可開環(huán)、重排成青霉烯酸，其降解的最終產(chǎn)物為青霉醛和青霉胺。
2．鑒別
（1）抑菌試驗(yàn)。通過對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用進(jìn)行鑒別。
鑒別方法：取本品與已知含量的青霉素適量，分別加水制成每1ml中約含50μg的溶液，各取1ml，加入不少于200單位的青霉素酶溶液1ml，在37℃滅活1小時(shí)后，取滅菌濾紙片，分別用上述溶液浸濕后，用濾紙吸去多余的液體，置攤布金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)約16小時(shí)后均無抑菌作用，而用同一方法檢查未經(jīng)青霉素酶滅活的溶液均有抑菌作用。
（2）沉淀反應(yīng)。根據(jù)本品的鹽和分子型溶解行為的差異進(jìn)行鑒別。
鑒別方法：取本品約0.1g，加水5ml溶解后，加稀鹽酸2滴，即生成白色沉淀；此沉淀能在乙醇、醋酸戊酯、氯仿、乙醚或過量的鹽酸中溶解。
本品為鈉鹽，易溶于水，加鹽酸2滴使成酸性后，轉(zhuǎn)化為分子型，難溶于水，即生成白色沉淀。此沉淀能溶解于有機(jī)溶劑中。在過量的鹽酸中，酰胺基成鹽，水溶性增大而溶解。
（3）紅外光譜法 《中國藥典》采用紅外光譜法鑒別本品，用溴化鉀壓片，主要特征峰如下表：
《中國藥典》規(guī)定，本品的紅外吸收光譜應(yīng)與對(duì)照品的圖譜一致。
（4）鈉鹽的火焰反應(yīng)。本品為鈉鹽，照《中國藥典》附錄“一般鑒別試驗(yàn)”中鈉鹽的火焰反應(yīng)方法試驗(yàn)。取鉑絲，用鹽酸濕潤后，蘸取供試品，在無色火焰中燃燒，火焰即顯鮮黃色。
3．檢查
（1）吸收度。青霉素鈉側(cè)鏈的苯環(huán)有紫外吸收，其水溶液在264nm的波長處有吸收，而降解產(chǎn)物在280nm處有吸收。取本品，加水制成每1ml中含1.80mg的溶液，照分光光度法，在280nm的波長處測(cè)定吸收度，不得大于0.10；在264nm的波長處有吸收，吸收度應(yīng)為0.80～0.88。
測(cè)定264nm處的吸收度是為了控制青霉素鈉的含量，規(guī)定280nm處的吸收度不得超過0.10，則是為了控制雜質(zhì)的量。
（2）水分。本品遇水易水解而失效，所以應(yīng)嚴(yán)格控制水分的含量?！吨袊幍洹芬?guī)定，用水分測(cè)定法（費(fèi)休法）測(cè)定，含水分不得超過0.5%。
（3）細(xì)菌內(nèi)毒素。本品由微生物發(fā)酵制得，易引入細(xì)菌內(nèi)毒素，《中國藥典》規(guī)定，照附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”檢查，每100單位青霉素中含細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)小于0.01EU。
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)的機(jī)理，來判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素是否符合規(guī)定的方法。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位（EU）來表示。
（4）無菌。取本品，用青霉素酶滅活后，按《中國藥典》附錄“無菌檢查法”檢查，應(yīng)符合規(guī)定。
無菌檢查法是將供試品溶液分別接種于需氧菌、厭氧菌和真菌培養(yǎng)基中，在規(guī)定條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，觀察是否有菌生長，來判斷供試品是否無菌。青霉素本身有抗菌作用，所以先用青霉素酶將其滅活后，再進(jìn)行檢查。
4．含量測(cè)定
《中國藥典》采用汞量法測(cè)定本品的含量。
青霉素分子不與汞鹽反應(yīng)，其堿性水解產(chǎn)物青霉噻唑酸及繼續(xù)水解生成的青霉胺都能與汞鹽定量反應(yīng)，根據(jù)消耗的汞鹽量可以計(jì)算青霉素的含量。
青霉素分子中的氫化噻唑環(huán)含由一個(gè)硫原子，開環(huán)后形成巰基（-SH），利用Hg2+與巰基的反應(yīng)測(cè)定其含量，反應(yīng)為：
Hg2+＋2R－SH→（RS）2Hg＋2H+
測(cè)定方法：取本品約50mg，精密稱定，加水5ml溶解后，加1mol/L氫氧化鈉溶液5ml，搖勻，放置15分鐘，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸鹽緩沖液（pH4.6）20ml及水20ml，搖勻，照電位滴定法，用鉑電極作為指示電極，汞一硫酸亞汞電極為參比電極，在35～40℃用硝酸汞滴定液（0.02mol/L）緩緩滴定，不計(jì)第一個(gè)等當(dāng)點(diǎn)，計(jì)算第二個(gè)等當(dāng)點(diǎn)時(shí)消耗滴定液的量，每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相當(dāng)于7.128mg的總青霉素（按C16H17N2NaO4S計(jì)算）。
另取本品約0.5g，精密稱定，加水與上述醋酸鹽緩沖液各25ml，振搖使完全溶解，在室溫下，立即用硝酸汞滴定液（0.02mol/L）滴定，滴定終點(diǎn)判斷方法同上。每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相當(dāng)于7.128mg降解物（按C16H17N2NaO4S計(jì)算）。
總青霉素的百分含量與降解物的百分含量之差值即為青霉素的含量。
滴定前加1mol/L的氫氧化鈉溶液5ml的目的是使藥物水解為青霉噻唑酸并繼續(xù)水解生成青霉胺，才能與Hg2+反應(yīng)。加堿水解后，加等量的硝酸中和，再加pH4.6的醋酸鹽緩沖液，方能進(jìn)行滴定。
由于Hg2+為+2價(jià)，在滴定曲線上可出現(xiàn)兩個(gè)突躍，計(jì)算時(shí)以第二個(gè)突躍為準(zhǔn)，此時(shí)青霉素鈉與Hg（N03）2反應(yīng)的摩爾比為1：1。
空白試驗(yàn)時(shí)，也要稱取供試品，但不經(jīng)水解直接滴定，目的是消除樣品中降解產(chǎn)物對(duì)測(cè)定的影響。
因?yàn)?mol的Hg（NO3）2相當(dāng)于1mol的青霉素鈉，青霉素鈉的分子量為356.38，所以1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相當(dāng)于7.128mg的青霉素鈉。計(jì)算含量測(cè)定結(jié)果時(shí)，先計(jì)算總青霉素的百分含量：
式中，V--消耗硝酸汞滴定液的體積，ml；C--硝酸汞滴定液的濃度，mol/L；W--樣品的稱樣量，mg。
再按相同的方法計(jì)算降解產(chǎn)物的百分含量。青霉素的百分含量為總青霉素的百分含量與降解產(chǎn)物百分含量之差。
青霉素含量（%）＝總青霉素含量（%）－降解產(chǎn)物含量（%）
5．貯藏
由于青霉紊鈉不穩(wěn)定，《中國藥典》規(guī)定本品的貯藏條件為：嚴(yán)封，在涼暗干燥處保存