第四節(jié) 含量測(cè)定
容量法、比色法、紫外分光光度法、熒光法、氣相色譜法、高效液相色譜法等，本章重點(diǎn)討論四氮唑比色法、異煙肼比色法、Kober反應(yīng)比色法、紫外分光光度法、高效液相色譜法等。
一、四氮唑比色法
（一）四氮唑的種類 兩種：2，3，5-三苯基氯化四氮唑（縮寫(xiě)為T(mén)TC），其還原產(chǎn)物為不溶于考，試大收集整理水的深紅色三苯甲簪，λmax在480~490nm，也稱紅四氮唑（縮寫(xiě)為RT）。藍(lán)四氮唑（縮寫(xiě)B(tài)T），其還原產(chǎn)物為暗藍(lán)色的雙甲簪，λmax在525nm左右。TTC和BT的結(jié)構(gòu)式如下：
（二）反應(yīng)原理
皮質(zhì)激素C17-α-醇酮基具有還原性，在強(qiáng)堿性溶液中能將四氮唑鹽定量地還原為有色甲簪。
可能路線為α-醇酮基，失去2個(gè)電子氧化為20-酮基-21醛基，在堿催化下，分子內(nèi)部重排；有部分形成20-羥基-21-醛基，C20-C21鍵斷裂形成甾基甲酸衍生物和甲醛，以前者為主。四氮唑鹽得到2個(gè)電子，開(kāi)環(huán)形成甲簪顯色。
（三）測(cè)定方法 USP（23）采用藍(lán)四氮唑；中國(guó)藥典（1995版）和BP（1993）采用紅四氮唑。
中國(guó)藥典收載地醋酸潑尼松龍軟膏的含量測(cè)定方法如下：
1.對(duì)照品溶液制備：精密稱取醋酸潑尼松龍對(duì)照品20mg，置100ml量瓶中，加無(wú)水乙醇振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。
2.供試品溶液的制備：精密稱取本品4g（約相當(dāng)于醋酸潑尼松龍20mg），置燒杯中，加無(wú)水乙醇約30ml，置水浴上加熱，充分?jǐn)嚢?，使醋酸潑尼松龍溶解，在置冰浴中放冷后，濾過(guò)，濾液濾入100ml量瓶中，同法提取3次，濾液并入量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
3.測(cè)定法：精密量取對(duì)照品溶液及供試品溶液各1ml，分別置干燥具塞試管中，各精密加無(wú)水乙醇9ml與氯化三苯四氮唑試液2ml，搖勻，再精密加氫氧化四甲基銨試液1ml，搖勻，在25℃暗處放置40~45min，照分光光度法，在485nm的波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度，計(jì)算，即得。
（四）討論 本法廣泛用于皮質(zhì)激素的測(cè)定，但測(cè)定時(shí)受結(jié)構(gòu)、溶劑、顯色溫度和時(shí)間、水分、堿的濃度、空氣中氧等，對(duì)反應(yīng)速度、呈色強(qiáng)度和穩(wěn)定性都有影響。
1.基團(tuán)的影響：C11-酮基反應(yīng)速度快于C11-羥基甾醇；C21-羥基酯化后較其母體羥基的反應(yīng)速度慢；當(dāng)酯化了的基團(tuán)為三甲基醋酸酯、磷酸酯或琥珀酸酯時(shí)，反應(yīng)更慢。
2.溶劑和水分的影響：5%以下不影響，超過(guò)大時(shí)，呈色速度減慢，采用無(wú)醛溶劑。
3.堿的種類和加入順序的影響：氫氧化四甲基銨較好，常用。但有研究表明，皮質(zhì)激素和氫氧化四甲基銨長(zhǎng)時(shí)間（24h）接觸后，皮質(zhì)激素有部分分解，因此，先加四氮唑鹽溶液再加堿液好。
4.空氣中氧及光線的影響：反應(yīng)及其產(chǎn)物對(duì)光敏感，因此必須用避光容器并置于暗處顯色，同時(shí)達(dá)到顯色時(shí)間后，立即測(cè)定吸收度。藍(lán)四氮唑?qū)?duì)空氣中氧敏感，明顯影響顏色強(qiáng)度和穩(wěn)定性，因此BP規(guī)定在加入試劑后要往容器中充氮?dú)狻?BR> 5.溫度與時(shí)間影響：顯色速度隨溫度增高而加快。一般以室溫或30℃恒溫條件下顯色，易得重線性較好的結(jié)果。BP（1993）多數(shù)在30℃反應(yīng)1h，中國(guó)藥典多數(shù)在25℃暗處反應(yīng)40~45min.
二、異煙肼比色法
（一）原理 甾體激素C3-酮基及某些其他位置上的酮基都能在酸性條件下與羰基試劑異煙肼縮合形成黃色異煙腙，在一定波長(zhǎng)下具有吸收。
某些具有兩個(gè)酮基的甾體激素可行成雙腙，如黃體酮、可的松氫化可的松等。
（二）測(cè)定方法 醋酸地塞米松軟膏含量測(cè)定方法如下：
1.對(duì)照品溶液制備：精密稱取醋酸地塞米松對(duì)照品25mg，置100ml量瓶中，加無(wú)水乙醇振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。精密 量取5ml，用無(wú)水乙醇稀釋至50ml，搖勻，即得。
2.供試品溶液的制備：精密稱取本品適量（約相當(dāng)于醋酸潑尼松龍2.5mg），置燒杯中，加無(wú)水乙醇約25ml，置水浴上加熱，充分?jǐn)嚢?，使醋酸地塞米松溶解，在置冰浴中放冷后，濾過(guò)，濾液濾入100ml量瓶中，同法提取3次，濾液并入量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
3.測(cè)定法：精密量取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10ml，分別置具塞容器中置考試，大收集整理水浴中蒸去乙醇，殘?jiān)屑勇确?0ml，振搖，使殘?jiān)芙猓骶芗?.1%異煙肼甲醇溶液（取異煙肼0.5g，加鹽酸0.63ml，加甲醇使溶解成500ml，即得）10ml，搖勻，置55℃暗處保溫45min，取出放冷至室溫，用氯仿稀釋至25ml，搖勻，照分光光度法，在415nm的波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度，計(jì)算，即得。
（三）討論
1.溶劑選擇：無(wú)水乙醇和甲醇好，其他受溶解度影響不能采用甲醇穩(wěn)定性較好，呈色強(qiáng)度較高。
2.酸的種類和濃度以及異煙肼的濃度：酸與異煙肼試劑的摩爾比為2：1時(shí)可獲得吸收度。
3.水分、溫度、光線和氧的影響：水增高吸收度降低，縮合水解；溫度升高，反應(yīng)加速。在實(shí)驗(yàn)條件下，光與氧不影響反應(yīng)。
4.反應(yīng)的專屬性：Δ4-3-酮基的甾體激素在室溫不到1h即可定量地與酸性異煙肼反應(yīng)；其他長(zhǎng)時(shí)間放置或加熱后方可反應(yīng)完全，因此在反應(yīng)條件下，本法對(duì)Δ4-3-酮基甾體具有一定的專屬性。
三、KOBER反應(yīng)比色法
指雌激素與硫酸-乙醇共熱呈色，用水或稀硫酸稀釋后重新加熱發(fā)生顏色改變，并在515nm附近有吸收。
反應(yīng)分兩步：與硫酸-乙醇共熱產(chǎn)生黃色，在465nm處有吸收；加水或稀硫酸稀釋重新加熱顯桃紅色，在515nm處有吸收。
可能原理：通過(guò)去羥基、重排及甲基由C13移到C17而形成產(chǎn)物（1）；然后被硫酸氧化形成具有較長(zhǎng)共扼雙鍵發(fā)色團(tuán)的產(chǎn)物（3）及進(jìn)一步生成具有吸收光譜紅移發(fā)色團(tuán)的產(chǎn)物（4）。
鐵-酚試劑文獻(xiàn)上也稱鐵-柯柏試劑。為硫酸亞鐵銨加水溶解后，加硫酸及過(guò)氧化氫，再與苯酚混合制成。改進(jìn)法，優(yōu)點(diǎn)：鐵加速速度和強(qiáng)度，加速黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，也增加穩(wěn)定性；酚加入，可以消除反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光并加速紅色的形成。
炔雌醇片的含量測(cè)定方法如下：
1.對(duì)照品溶液制備：精密稱取炔雌醇對(duì)照品25mg，置100ml量瓶中，加無(wú)水乙醇振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻；精密 量取2ml，用無(wú)水乙醇稀釋至50ml，搖勻，即得（10μg/ml）。
2.供試品溶液的制備：取本品10片或20片，置具塞試管中，加水10ml，振搖使崩散、置水浴上加熱至半透明，放冷，精密加氯仿10ml，密塞，振搖20min，靜置分層后，吸取上層水溶液，加無(wú)水硫酸鈉0.5g，振搖脫水后，經(jīng)干燥濾紙濾過(guò)，棄取初濾液，精密量取續(xù)濾液2ml，置水浴中蒸干后，低溫干燥，放冷，精密加無(wú)水乙醇使溶解成每1ml中約含10μg的溶液，即得。
3.測(cè)定法：精密量取對(duì)照品溶液及供試品溶液各1ml，分別置試管中，在冰浴中冷卻，各精密滴加硫酸-乙醇（4：1）4ml，搖勻顯色后，在530nm的波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度，計(jì)算，即得。
四、紫外分光光度法
許多甾體激素分子中存在Δ4-3-酮基（C=C-C=O）和苯環(huán)（C=C-C=C）共扼系統(tǒng)，因而在紫外光區(qū)有特征吸收，240nm附近有吸收，有苯環(huán)的在280nm附近有吸收，可用于含量測(cè)定。
95版中國(guó)藥典中25中甾體激素原料及片劑用該法測(cè)定含量，占本類藥物分析的28%，僅次于HPLC.
紫外分光光度法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，被廣泛用于原料和制劑的分析，但在片劑分析時(shí)需要預(yù)處理排除干擾。
醋酸可的松片的測(cè)定方法：
取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（相當(dāng)于醋酸可的松20mg），置100ml量瓶中，加無(wú)水乙醇75ml，時(shí)時(shí)振搖約1h，使醋酸可的松溶解，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，用干燥濾紙濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5ml，置另一100ml量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，照分光光度法，在238nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，按醋酸可的松的吸收系數(shù)（E1%1cm）為390計(jì)算，即得。
五、高效液相色譜法
特點(diǎn)：樣品用量少、靈敏度高、分離效能好、快速等優(yōu)點(diǎn)，各國(guó)藥典多采用。中國(guó)藥典89中甾體激素原料和制劑中，有43種采用HPLC法（內(nèi)標(biāo)法多），占該類藥物分析方法的48%，居首位。反相分配色譜最廣。固定相常用十八烷基硅烷鍵和硅膠；流動(dòng)相甲醇-水-乙醚、乙腈-水-乙丙醇、甲醇-四氫呋喃-水、甲醇-乙腈-水等的混合液。為了提高分離效率、獲得滿意的峰形，有時(shí)在流動(dòng)相中加入醋酸緩沖液或磷酸緩沖液調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，紫外直接檢測(cè)。
醋酸潑尼松龍的測(cè)定方法如下：
1.色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充柱，甲醇-水（70：30）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm.理論塔板數(shù)按醋酸潑尼松龍計(jì)算應(yīng)不低于3000，醋酸潑尼松龍和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求。
2.內(nèi)標(biāo)溶液的制備 取醋酸氟氫松，加甲醇制成每1ml中含0.50mg的溶液，即得。
3.測(cè)定法 取醋酸潑尼松龍對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1ml中約含0.50mg的溶液；精密量取該溶液與內(nèi)標(biāo)溶液各5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；取5μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取本品適量，同法測(cè)定，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。
甾體激素類藥物的分析
1、分類和結(jié)構(gòu)特征與分析的關(guān)系：
（1）分類：腎上腺皮質(zhì)激素，雄性激素及蛋白考，試大收集整理同化激素，性激素，孕激素，唯激素
（2）結(jié)構(gòu)特征與分析的關(guān)系
（a）△4-3-酮基：可與羰基試劑發(fā)生縮合反應(yīng)，可供鑒別及含量測(cè)定；
（b）17-α-醇酮基：具還原性，可與Feling‘s試劑反應(yīng)生成紅色氧化亞銅，也可與硫酸苯肼作用呈色，可供鑒別及含量測(cè)定；
2、特殊雜質(zhì)檢查方法：
本他甾體用TLC法檢查。
3、含量測(cè)定方法：
HPLC法
四氮唑比色法。
容量法、比色法、紫外分光光度法、熒光法、氣相色譜法、高效液相色譜法等，本章重點(diǎn)討論四氮唑比色法、異煙肼比色法、Kober反應(yīng)比色法、紫外分光光度法、高效液相色譜法等。
一、四氮唑比色法
（一）四氮唑的種類 兩種：2，3，5-三苯基氯化四氮唑（縮寫(xiě)為T(mén)TC），其還原產(chǎn)物為不溶于考，試大收集整理水的深紅色三苯甲簪，λmax在480~490nm，也稱紅四氮唑（縮寫(xiě)為RT）。藍(lán)四氮唑（縮寫(xiě)B(tài)T），其還原產(chǎn)物為暗藍(lán)色的雙甲簪，λmax在525nm左右。TTC和BT的結(jié)構(gòu)式如下：
（二）反應(yīng)原理
皮質(zhì)激素C17-α-醇酮基具有還原性，在強(qiáng)堿性溶液中能將四氮唑鹽定量地還原為有色甲簪。
可能路線為α-醇酮基，失去2個(gè)電子氧化為20-酮基-21醛基，在堿催化下，分子內(nèi)部重排；有部分形成20-羥基-21-醛基，C20-C21鍵斷裂形成甾基甲酸衍生物和甲醛，以前者為主。四氮唑鹽得到2個(gè)電子，開(kāi)環(huán)形成甲簪顯色。
（三）測(cè)定方法 USP（23）采用藍(lán)四氮唑；中國(guó)藥典（1995版）和BP（1993）采用紅四氮唑。
中國(guó)藥典收載地醋酸潑尼松龍軟膏的含量測(cè)定方法如下：
1.對(duì)照品溶液制備：精密稱取醋酸潑尼松龍對(duì)照品20mg，置100ml量瓶中，加無(wú)水乙醇振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。
2.供試品溶液的制備：精密稱取本品4g（約相當(dāng)于醋酸潑尼松龍20mg），置燒杯中，加無(wú)水乙醇約30ml，置水浴上加熱，充分?jǐn)嚢?，使醋酸潑尼松龍溶解，在置冰浴中放冷后，濾過(guò)，濾液濾入100ml量瓶中，同法提取3次，濾液并入量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
3.測(cè)定法：精密量取對(duì)照品溶液及供試品溶液各1ml，分別置干燥具塞試管中，各精密加無(wú)水乙醇9ml與氯化三苯四氮唑試液2ml，搖勻，再精密加氫氧化四甲基銨試液1ml，搖勻，在25℃暗處放置40~45min，照分光光度法，在485nm的波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度，計(jì)算，即得。
（四）討論 本法廣泛用于皮質(zhì)激素的測(cè)定，但測(cè)定時(shí)受結(jié)構(gòu)、溶劑、顯色溫度和時(shí)間、水分、堿的濃度、空氣中氧等，對(duì)反應(yīng)速度、呈色強(qiáng)度和穩(wěn)定性都有影響。
1.基團(tuán)的影響：C11-酮基反應(yīng)速度快于C11-羥基甾醇；C21-羥基酯化后較其母體羥基的反應(yīng)速度慢；當(dāng)酯化了的基團(tuán)為三甲基醋酸酯、磷酸酯或琥珀酸酯時(shí)，反應(yīng)更慢。
2.溶劑和水分的影響：5%以下不影響，超過(guò)大時(shí)，呈色速度減慢，采用無(wú)醛溶劑。
3.堿的種類和加入順序的影響：氫氧化四甲基銨較好，常用。但有研究表明，皮質(zhì)激素和氫氧化四甲基銨長(zhǎng)時(shí)間（24h）接觸后，皮質(zhì)激素有部分分解，因此，先加四氮唑鹽溶液再加堿液好。
4.空氣中氧及光線的影響：反應(yīng)及其產(chǎn)物對(duì)光敏感，因此必須用避光容器并置于暗處顯色，同時(shí)達(dá)到顯色時(shí)間后，立即測(cè)定吸收度。藍(lán)四氮唑?qū)?duì)空氣中氧敏感，明顯影響顏色強(qiáng)度和穩(wěn)定性，因此BP規(guī)定在加入試劑后要往容器中充氮?dú)狻?BR> 5.溫度與時(shí)間影響：顯色速度隨溫度增高而加快。一般以室溫或30℃恒溫條件下顯色，易得重線性較好的結(jié)果。BP（1993）多數(shù)在30℃反應(yīng)1h，中國(guó)藥典多數(shù)在25℃暗處反應(yīng)40~45min.
二、異煙肼比色法
（一）原理 甾體激素C3-酮基及某些其他位置上的酮基都能在酸性條件下與羰基試劑異煙肼縮合形成黃色異煙腙，在一定波長(zhǎng)下具有吸收。
某些具有兩個(gè)酮基的甾體激素可行成雙腙，如黃體酮、可的松氫化可的松等。
（二）測(cè)定方法 醋酸地塞米松軟膏含量測(cè)定方法如下：
1.對(duì)照品溶液制備：精密稱取醋酸地塞米松對(duì)照品25mg，置100ml量瓶中，加無(wú)水乙醇振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。精密 量取5ml，用無(wú)水乙醇稀釋至50ml，搖勻，即得。
2.供試品溶液的制備：精密稱取本品適量（約相當(dāng)于醋酸潑尼松龍2.5mg），置燒杯中，加無(wú)水乙醇約25ml，置水浴上加熱，充分?jǐn)嚢?，使醋酸地塞米松溶解，在置冰浴中放冷后，濾過(guò)，濾液濾入100ml量瓶中，同法提取3次，濾液并入量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
3.測(cè)定法：精密量取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10ml，分別置具塞容器中置考試，大收集整理水浴中蒸去乙醇，殘?jiān)屑勇确?0ml，振搖，使殘?jiān)芙猓骶芗?.1%異煙肼甲醇溶液（取異煙肼0.5g，加鹽酸0.63ml，加甲醇使溶解成500ml，即得）10ml，搖勻，置55℃暗處保溫45min，取出放冷至室溫，用氯仿稀釋至25ml，搖勻，照分光光度法，在415nm的波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度，計(jì)算，即得。
（三）討論
1.溶劑選擇：無(wú)水乙醇和甲醇好，其他受溶解度影響不能采用甲醇穩(wěn)定性較好，呈色強(qiáng)度較高。
2.酸的種類和濃度以及異煙肼的濃度：酸與異煙肼試劑的摩爾比為2：1時(shí)可獲得吸收度。
3.水分、溫度、光線和氧的影響：水增高吸收度降低，縮合水解；溫度升高，反應(yīng)加速。在實(shí)驗(yàn)條件下，光與氧不影響反應(yīng)。
4.反應(yīng)的專屬性：Δ4-3-酮基的甾體激素在室溫不到1h即可定量地與酸性異煙肼反應(yīng)；其他長(zhǎng)時(shí)間放置或加熱后方可反應(yīng)完全，因此在反應(yīng)條件下，本法對(duì)Δ4-3-酮基甾體具有一定的專屬性。
三、KOBER反應(yīng)比色法
指雌激素與硫酸-乙醇共熱呈色，用水或稀硫酸稀釋后重新加熱發(fā)生顏色改變，并在515nm附近有吸收。
反應(yīng)分兩步：與硫酸-乙醇共熱產(chǎn)生黃色，在465nm處有吸收；加水或稀硫酸稀釋重新加熱顯桃紅色，在515nm處有吸收。
可能原理：通過(guò)去羥基、重排及甲基由C13移到C17而形成產(chǎn)物（1）；然后被硫酸氧化形成具有較長(zhǎng)共扼雙鍵發(fā)色團(tuán)的產(chǎn)物（3）及進(jìn)一步生成具有吸收光譜紅移發(fā)色團(tuán)的產(chǎn)物（4）。
鐵-酚試劑文獻(xiàn)上也稱鐵-柯柏試劑。為硫酸亞鐵銨加水溶解后，加硫酸及過(guò)氧化氫，再與苯酚混合制成。改進(jìn)法，優(yōu)點(diǎn)：鐵加速速度和強(qiáng)度，加速黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，也增加穩(wěn)定性；酚加入，可以消除反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光并加速紅色的形成。
炔雌醇片的含量測(cè)定方法如下：
1.對(duì)照品溶液制備：精密稱取炔雌醇對(duì)照品25mg，置100ml量瓶中，加無(wú)水乙醇振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻；精密 量取2ml，用無(wú)水乙醇稀釋至50ml，搖勻，即得（10μg/ml）。
2.供試品溶液的制備：取本品10片或20片，置具塞試管中，加水10ml，振搖使崩散、置水浴上加熱至半透明，放冷，精密加氯仿10ml，密塞，振搖20min，靜置分層后，吸取上層水溶液，加無(wú)水硫酸鈉0.5g，振搖脫水后，經(jīng)干燥濾紙濾過(guò)，棄取初濾液，精密量取續(xù)濾液2ml，置水浴中蒸干后，低溫干燥，放冷，精密加無(wú)水乙醇使溶解成每1ml中約含10μg的溶液，即得。
3.測(cè)定法：精密量取對(duì)照品溶液及供試品溶液各1ml，分別置試管中，在冰浴中冷卻，各精密滴加硫酸-乙醇（4：1）4ml，搖勻顯色后，在530nm的波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度，計(jì)算，即得。
四、紫外分光光度法
許多甾體激素分子中存在Δ4-3-酮基（C=C-C=O）和苯環(huán)（C=C-C=C）共扼系統(tǒng)，因而在紫外光區(qū)有特征吸收，240nm附近有吸收，有苯環(huán)的在280nm附近有吸收，可用于含量測(cè)定。
95版中國(guó)藥典中25中甾體激素原料及片劑用該法測(cè)定含量，占本類藥物分析的28%，僅次于HPLC.
紫外分光光度法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，被廣泛用于原料和制劑的分析，但在片劑分析時(shí)需要預(yù)處理排除干擾。
醋酸可的松片的測(cè)定方法：
取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（相當(dāng)于醋酸可的松20mg），置100ml量瓶中，加無(wú)水乙醇75ml，時(shí)時(shí)振搖約1h，使醋酸可的松溶解，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，用干燥濾紙濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5ml，置另一100ml量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，照分光光度法，在238nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，按醋酸可的松的吸收系數(shù)（E1%1cm）為390計(jì)算，即得。
五、高效液相色譜法
特點(diǎn)：樣品用量少、靈敏度高、分離效能好、快速等優(yōu)點(diǎn)，各國(guó)藥典多采用。中國(guó)藥典89中甾體激素原料和制劑中，有43種采用HPLC法（內(nèi)標(biāo)法多），占該類藥物分析方法的48%，居首位。反相分配色譜最廣。固定相常用十八烷基硅烷鍵和硅膠；流動(dòng)相甲醇-水-乙醚、乙腈-水-乙丙醇、甲醇-四氫呋喃-水、甲醇-乙腈-水等的混合液。為了提高分離效率、獲得滿意的峰形，有時(shí)在流動(dòng)相中加入醋酸緩沖液或磷酸緩沖液調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，紫外直接檢測(cè)。
醋酸潑尼松龍的測(cè)定方法如下：
1.色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充柱，甲醇-水（70：30）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm.理論塔板數(shù)按醋酸潑尼松龍計(jì)算應(yīng)不低于3000，醋酸潑尼松龍和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求。
2.內(nèi)標(biāo)溶液的制備 取醋酸氟氫松，加甲醇制成每1ml中含0.50mg的溶液，即得。
3.測(cè)定法 取醋酸潑尼松龍對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1ml中約含0.50mg的溶液；精密量取該溶液與內(nèi)標(biāo)溶液各5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；取5μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取本品適量，同法測(cè)定，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。
甾體激素類藥物的分析
1、分類和結(jié)構(gòu)特征與分析的關(guān)系：
（1）分類：腎上腺皮質(zhì)激素，雄性激素及蛋白考，試大收集整理同化激素，性激素，孕激素，唯激素
（2）結(jié)構(gòu)特征與分析的關(guān)系
（a）△4-3-酮基：可與羰基試劑發(fā)生縮合反應(yīng)，可供鑒別及含量測(cè)定；
（b）17-α-醇酮基：具還原性，可與Feling‘s試劑反應(yīng)生成紅色氧化亞銅，也可與硫酸苯肼作用呈色，可供鑒別及含量測(cè)定；
2、特殊雜質(zhì)檢查方法：
本他甾體用TLC法檢查。
3、含量測(cè)定方法：
HPLC法
四氮唑比色法。