掌握異煙肼、尼可剎米的鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測定方法。
掌握鹽酸氯丙嗪、奮乃靜的鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測定方法。
掌握地西泮、氯氮卓及其制劑的鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測定方法。
本章討論化學(xué)合成的雜環(huán)類藥物，選擇應(yīng)用比較廣泛的三類雜環(huán)藥物中的幾個(gè)典型考，試大收集整理藥物予以重點(diǎn)介紹：即吡啶類中的尼可剎米、異煙肼、異煙腙和丙硫異煙胺等；吩噻嗪類中的氯丙嗪、異丙嗪、奮乃靜和癸氟奮乃靜等；苯駢二氮雜卓類中的地西泮、阿普唑侖和氯氮卓等。
第一節(jié) 吡啶類藥物的分析
一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)
（一）典型藥物的結(jié)構(gòu)
尼可剎米、異煙肼、異煙腙、丙硫異煙胺
（二）主要化學(xué)性質(zhì)
1.弱堿性 本類藥物母核吡啶環(huán)上的氮原子為堿性氮原子，吡啶環(huán)的pKb值為8.8（水中）。尼可剎米分子結(jié)構(gòu)中，除了吡啶環(huán)上氮原子外，吡啶環(huán)β位上被酰氨基取代，雖然酰氨基的化學(xué)性質(zhì)不甚活潑，但遇堿水解后，釋放出具有堿性的二乙胺，故可以此進(jìn)行鑒別。
2.吡啶環(huán)的特性 本類藥物分子結(jié)構(gòu)中均含有吡啶環(huán)，可發(fā)生開環(huán)反應(yīng)（特性反應(yīng)）。尼可剎米、異煙肼和異煙腙的吡啶環(huán)α、α‘位未取代，而β或γ位被羧基衍生物所取代，丙硫異煙胺的吡啶環(huán)α位被丙基取代，而γ位被硫代甲酰氨基所取代。
3.還原性異煙肼吡啶環(huán)γ位上被酰肼取代，酰肼基具有較強(qiáng)的還原性，并可與某些含羰基的試劑發(fā)生縮合反應(yīng)。
除此之外，各藥物具有不同的取代基團(tuán)，具有不同的化學(xué)性質(zhì)。
二、鑒別試驗(yàn)
（一）吡啶環(huán)的開環(huán)反應(yīng)
1.戊烯二醛反應(yīng)（Konig反應(yīng)） 當(dāng)溴化氰與芳香第一胺作用于吡啶環(huán)，可形成戊烯二醛的有色喜夫氏堿類（聚甲炔染料）。這一反應(yīng)不能由吡啶環(huán)單獨(dú)發(fā)生，而是在溴化氰加到吡啶環(huán)，使環(huán)上氮原子由3價(jià)轉(zhuǎn)變成5價(jià)時(shí)，吡啶環(huán)水解，形成戊烯二醛后再與芳香第一胺縮合而成。
本反應(yīng)適用于吡啶環(huán)α、α‘位未取代，以及β或γ位為烷基或羧基的衍生物。異煙肼和尼可剎米均具有此反應(yīng)，而中國藥典只用于尼可剎米的鑒別，所用芳香第一胺為苯胺。
方法取本品1滴，加水50ml，搖勻，分取2ml，加溴化氰試液2ml與2.5％苯胺溶液3ml，搖勻，溶液漸顯黃色。
用于異煙肼鑒別時(shí)，應(yīng)先用高錳酸鉀或溴水氧化為異煙酸，再與溴化氰作用，然后再與芳香第一胺縮合形成有色的戊烯二醛衍生物。戊烯二醛衍生物的顏色隨所用芳香第一胺不同而有所不同，如與苯胺縮合形成黃至黃棕色；與聯(lián)苯胺則形成淡紅至紅色。
2.二硝基氯苯反應(yīng)（Vongerichten反應(yīng)） 在無水條件下，將吡啶及其某些衍生物與2，4-二硝基氯苯混合，加熱或使其熱至熔融，冷卻后，加醇制氫氧化鉀溶液將殘?jiān)芙猓芤撼首霞t色。
尼可剎米、異煙肼和異煙腙等，需經(jīng)適當(dāng)處理，即將酰肼氧化成羧基或?qū)Ⅴ０匪鉃轸然蟛庞写朔磻?yīng)。中國藥典已用于異煙腙的鑒別。
用于異煙肼鑒別時(shí)，可取其乙醇溶液加入硼砂及5％2，4-二硝基氯苯乙醇溶液，蒸干，繼續(xù)加熱10min，殘?jiān)蛹状紨嚢韬?，即顯紫紅色。
（二）形成沉淀的反應(yīng)
本類藥物具有吡啶環(huán)的結(jié)構(gòu)，可與重金屬鹽類（如氯化汞、硫酸銅、碘化鉍鉀）及苦味酸等試劑形成沉淀。如尼可剎米可與硫酸銅及硫氰酸銨作用生成草綠色配位化合物沉淀。異煙肼、尼可剎米可與氯化汞形成白色沉淀。
（三）酰肼基團(tuán)的反應(yīng)
1.還原反應(yīng) 銀鏡反應(yīng)：方法 取異煙肼約10mg，置試管中，加水2ml溶解后，加氨制硝酸銀考試，大收集整理試液1ml，即發(fā)生氣泡與黑色渾濁，并在試管壁上生成銀鏡。反應(yīng)式如下：
2.縮合反應(yīng) 酰肼基與芳醛縮合形成腙，析出結(jié)晶，可測定其熔點(diǎn)。最常用的芳醛為香草醛，其次是對二甲氨基苯甲醛、水楊醛等
與1，2－萘醌－4－磺酸在堿性介質(zhì)中可縮合顯紅色，凡具有－NH2或活性－CH2－基者均有此反應(yīng)。
（四）分解產(chǎn)物的反應(yīng)
尼可剎米+氫氧化鈉試液→加熱→二乙胺臭味，紅色石蕊試紙變藍(lán)；
丙硫異煙胺加鹽酸→加熱→硫化氫氣體，醋酸鉛試紙顯黑色。
（五）紫外吸收光譜特征
本類藥物的紫外特征吸收鑒別方法見表。
三、有關(guān)物質(zhì)的檢查
（一）異煙肼中游離肼的檢查
異煙肼是一種不穩(wěn)定的藥物，其中的游離肼是由制備時(shí)原料引入，或在貯存過程中降解而產(chǎn)生。而肼又是一種誘變劑和致癌物質(zhì)，因此國內(nèi)外藥典多數(shù)規(guī)定了異煙肼原料藥及其制劑中游離肼的限量檢查。常用的方法有薄層色譜法，比濁法和差示分光光度法。
1.薄層色譜法中國藥典對異煙肼原料和注射用異煙肼中游離肼的檢查均采用此法。
檢查方法 取本品，加水制成每1ml中含50mg的溶液，作為供試品溶液。另取硫酸肼加水制成每1ml中含0.20mg（相當(dāng)于游離肼50μg）的溶液，作為對照溶液。吸取供試液10μl與對照溶液2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠薄層板（用羧甲基纖維素鈉溶液制備）上，以異丙醇－丙酮（3：2）為展開劑，展開后，晾干，噴以乙醇制對二甲氨基苯甲醛試液，15min后檢視，在供試品主斑點(diǎn)前方與硫酸肼斑點(diǎn)相應(yīng)的位置上，不得顯黃色斑點(diǎn)。
異煙肼斑點(diǎn)呈棕橙色的清晰斑點(diǎn)，Rf值約為0.21.游離肼斑點(diǎn)呈鮮黃色，Rf值約為0.3.檢出限量約為0.02％。本法檢出肼的靈敏度為0.1μg.
BP（1993）亦采用本法檢查“游離肼及有關(guān)物質(zhì)”，其檢查方法如下：
比濁法
差示分光光度法利用游離肼與對-二甲氨基苯甲醛可形成黃色縮合產(chǎn)物（對-二甲氨基苯甲醛連氮），于456nm波長處有吸收；而異煙肼與上述試劑形成的縮合產(chǎn)物（對-二甲氨基芐叉）在此波長處無吸收；根據(jù)這一性質(zhì)，同時(shí)運(yùn)用差示分光光度法，在參比溶液中加3%（V/V）的丙酮，可與肼生成無色的二甲基甲酮連氮，在456nm波長處無吸收；而異煙肼（干擾組分）生成的縮合物在456nm波長處的吸收度與供試溶液（不含丙酮）的吸收度相等，即△A456nm為零，對游離肼測定無干擾。進(jìn)而，可在456nm波長處測定并計(jì)算二者的差示吸收度△A456nm，同時(shí)以對照品比較法計(jì)算游離肼含量。
參比溶液中丙酮含量在3%時(shí)，異煙肼（干擾組分）生成的縮合物在456nm波長處的吸收度與供試溶液（不含丙酮）的吸收度相等，即△A456nm為零，對游離肼測定無干擾。若添加的丙酮量高于或低于3%時(shí)，均不能使異煙肼的△A456nm為零。
測定方法如下：
對照品溶液的制備與測定
供試品溶液的制備與測定
（二）尼可剎米中有關(guān)物質(zhì)檢查——TLC高低濃度對照法
四、含量測定
（一）異煙肼的含量測定
異煙肼含量測定方法的依據(jù)是：具有還原性和能與一些試劑縮合的酰肼基以及吡啶的堿性。常見的方法有溴酸鉀法、碘量法、溴量法、非水堿量法或酸量法、非水分光光度法及比色法。其中以溴酸鉀法、碘量法、溴量法最為常用。中國藥典（1963年版）曾采用溴量法測定異煙肼的含量。由于溴在稀考，試大收集整理鹽酸介質(zhì)中氧化異煙肼，剩余的溴液用碘量法進(jìn)行測定。本法因操作繁瑣、準(zhǔn)確度差等原因，故在1977年版藥典中改為溴酸鉀法。
1. 溴酸鉀法 我國藥典自1977年版改為在強(qiáng)酸性溶液中用溴酸鉀滴定液直接滴定法，用不可逆指示劑乙氧基黃叱精指示終點(diǎn)。由于本法操作簡單、準(zhǔn)確，1995年版仍用溴酸鉀法，但改用甲基橙指示劑指示終點(diǎn)；同時(shí)采用本法測定異煙肼片和注射劑的含量。
測定方法 取本品約0.2g，精密稱定，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取25ml，加水50ml、鹽酸20ml與甲基橙指示劑1滴，用溴酸鉀滴定液（0.01667mol/L）緩緩滴定（溫度保持在18～25℃）至粉紅色消失。每1ml的溴酸鉀滴定液（0.01667mol/L）相當(dāng)于3.429mg的C6H7N3O.
2.剩余碘量法
3.非水溶液滴定法
（二）異煙腙及尼可剎米的含量測定
1.非水溶液滴定法——異煙腙及其片劑；尼可剎米原料藥
2.紫外分光光度法——尼可剎米注射液
（三）丙硫異煙胺的含量測定
原料藥——非水溶液滴定法；片劑——銀量法
掌握鹽酸氯丙嗪、奮乃靜的鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測定方法。
掌握地西泮、氯氮卓及其制劑的鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測定方法。
本章討論化學(xué)合成的雜環(huán)類藥物，選擇應(yīng)用比較廣泛的三類雜環(huán)藥物中的幾個(gè)典型考，試大收集整理藥物予以重點(diǎn)介紹：即吡啶類中的尼可剎米、異煙肼、異煙腙和丙硫異煙胺等；吩噻嗪類中的氯丙嗪、異丙嗪、奮乃靜和癸氟奮乃靜等；苯駢二氮雜卓類中的地西泮、阿普唑侖和氯氮卓等。
第一節(jié) 吡啶類藥物的分析
一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)
（一）典型藥物的結(jié)構(gòu)
尼可剎米、異煙肼、異煙腙、丙硫異煙胺
（二）主要化學(xué)性質(zhì)
1.弱堿性 本類藥物母核吡啶環(huán)上的氮原子為堿性氮原子，吡啶環(huán)的pKb值為8.8（水中）。尼可剎米分子結(jié)構(gòu)中，除了吡啶環(huán)上氮原子外，吡啶環(huán)β位上被酰氨基取代，雖然酰氨基的化學(xué)性質(zhì)不甚活潑，但遇堿水解后，釋放出具有堿性的二乙胺，故可以此進(jìn)行鑒別。
2.吡啶環(huán)的特性 本類藥物分子結(jié)構(gòu)中均含有吡啶環(huán)，可發(fā)生開環(huán)反應(yīng)（特性反應(yīng)）。尼可剎米、異煙肼和異煙腙的吡啶環(huán)α、α‘位未取代，而β或γ位被羧基衍生物所取代，丙硫異煙胺的吡啶環(huán)α位被丙基取代，而γ位被硫代甲酰氨基所取代。
3.還原性異煙肼吡啶環(huán)γ位上被酰肼取代，酰肼基具有較強(qiáng)的還原性，并可與某些含羰基的試劑發(fā)生縮合反應(yīng)。
除此之外，各藥物具有不同的取代基團(tuán)，具有不同的化學(xué)性質(zhì)。
二、鑒別試驗(yàn)
（一）吡啶環(huán)的開環(huán)反應(yīng)
1.戊烯二醛反應(yīng)（Konig反應(yīng)） 當(dāng)溴化氰與芳香第一胺作用于吡啶環(huán)，可形成戊烯二醛的有色喜夫氏堿類（聚甲炔染料）。這一反應(yīng)不能由吡啶環(huán)單獨(dú)發(fā)生，而是在溴化氰加到吡啶環(huán)，使環(huán)上氮原子由3價(jià)轉(zhuǎn)變成5價(jià)時(shí)，吡啶環(huán)水解，形成戊烯二醛后再與芳香第一胺縮合而成。
本反應(yīng)適用于吡啶環(huán)α、α‘位未取代，以及β或γ位為烷基或羧基的衍生物。異煙肼和尼可剎米均具有此反應(yīng)，而中國藥典只用于尼可剎米的鑒別，所用芳香第一胺為苯胺。
方法取本品1滴，加水50ml，搖勻，分取2ml，加溴化氰試液2ml與2.5％苯胺溶液3ml，搖勻，溶液漸顯黃色。
用于異煙肼鑒別時(shí)，應(yīng)先用高錳酸鉀或溴水氧化為異煙酸，再與溴化氰作用，然后再與芳香第一胺縮合形成有色的戊烯二醛衍生物。戊烯二醛衍生物的顏色隨所用芳香第一胺不同而有所不同，如與苯胺縮合形成黃至黃棕色；與聯(lián)苯胺則形成淡紅至紅色。
2.二硝基氯苯反應(yīng)（Vongerichten反應(yīng)） 在無水條件下，將吡啶及其某些衍生物與2，4-二硝基氯苯混合，加熱或使其熱至熔融，冷卻后，加醇制氫氧化鉀溶液將殘?jiān)芙猓芤撼首霞t色。
尼可剎米、異煙肼和異煙腙等，需經(jīng)適當(dāng)處理，即將酰肼氧化成羧基或?qū)Ⅴ０匪鉃轸然蟛庞写朔磻?yīng)。中國藥典已用于異煙腙的鑒別。
用于異煙肼鑒別時(shí)，可取其乙醇溶液加入硼砂及5％2，4-二硝基氯苯乙醇溶液，蒸干，繼續(xù)加熱10min，殘?jiān)蛹状紨嚢韬?，即顯紫紅色。
（二）形成沉淀的反應(yīng)
本類藥物具有吡啶環(huán)的結(jié)構(gòu)，可與重金屬鹽類（如氯化汞、硫酸銅、碘化鉍鉀）及苦味酸等試劑形成沉淀。如尼可剎米可與硫酸銅及硫氰酸銨作用生成草綠色配位化合物沉淀。異煙肼、尼可剎米可與氯化汞形成白色沉淀。
（三）酰肼基團(tuán)的反應(yīng)
1.還原反應(yīng) 銀鏡反應(yīng)：方法 取異煙肼約10mg，置試管中，加水2ml溶解后，加氨制硝酸銀考試，大收集整理試液1ml，即發(fā)生氣泡與黑色渾濁，并在試管壁上生成銀鏡。反應(yīng)式如下：
2.縮合反應(yīng) 酰肼基與芳醛縮合形成腙，析出結(jié)晶，可測定其熔點(diǎn)。最常用的芳醛為香草醛，其次是對二甲氨基苯甲醛、水楊醛等
與1，2－萘醌－4－磺酸在堿性介質(zhì)中可縮合顯紅色，凡具有－NH2或活性－CH2－基者均有此反應(yīng)。
（四）分解產(chǎn)物的反應(yīng)
尼可剎米+氫氧化鈉試液→加熱→二乙胺臭味，紅色石蕊試紙變藍(lán)；
丙硫異煙胺加鹽酸→加熱→硫化氫氣體，醋酸鉛試紙顯黑色。
（五）紫外吸收光譜特征
本類藥物的紫外特征吸收鑒別方法見表。
三、有關(guān)物質(zhì)的檢查
（一）異煙肼中游離肼的檢查
異煙肼是一種不穩(wěn)定的藥物，其中的游離肼是由制備時(shí)原料引入，或在貯存過程中降解而產(chǎn)生。而肼又是一種誘變劑和致癌物質(zhì)，因此國內(nèi)外藥典多數(shù)規(guī)定了異煙肼原料藥及其制劑中游離肼的限量檢查。常用的方法有薄層色譜法，比濁法和差示分光光度法。
1.薄層色譜法中國藥典對異煙肼原料和注射用異煙肼中游離肼的檢查均采用此法。
檢查方法 取本品，加水制成每1ml中含50mg的溶液，作為供試品溶液。另取硫酸肼加水制成每1ml中含0.20mg（相當(dāng)于游離肼50μg）的溶液，作為對照溶液。吸取供試液10μl與對照溶液2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠薄層板（用羧甲基纖維素鈉溶液制備）上，以異丙醇－丙酮（3：2）為展開劑，展開后，晾干，噴以乙醇制對二甲氨基苯甲醛試液，15min后檢視，在供試品主斑點(diǎn)前方與硫酸肼斑點(diǎn)相應(yīng)的位置上，不得顯黃色斑點(diǎn)。
異煙肼斑點(diǎn)呈棕橙色的清晰斑點(diǎn)，Rf值約為0.21.游離肼斑點(diǎn)呈鮮黃色，Rf值約為0.3.檢出限量約為0.02％。本法檢出肼的靈敏度為0.1μg.
BP（1993）亦采用本法檢查“游離肼及有關(guān)物質(zhì)”，其檢查方法如下：
比濁法
差示分光光度法利用游離肼與對-二甲氨基苯甲醛可形成黃色縮合產(chǎn)物（對-二甲氨基苯甲醛連氮），于456nm波長處有吸收；而異煙肼與上述試劑形成的縮合產(chǎn)物（對-二甲氨基芐叉）在此波長處無吸收；根據(jù)這一性質(zhì)，同時(shí)運(yùn)用差示分光光度法，在參比溶液中加3%（V/V）的丙酮，可與肼生成無色的二甲基甲酮連氮，在456nm波長處無吸收；而異煙肼（干擾組分）生成的縮合物在456nm波長處的吸收度與供試溶液（不含丙酮）的吸收度相等，即△A456nm為零，對游離肼測定無干擾。進(jìn)而，可在456nm波長處測定并計(jì)算二者的差示吸收度△A456nm，同時(shí)以對照品比較法計(jì)算游離肼含量。
參比溶液中丙酮含量在3%時(shí)，異煙肼（干擾組分）生成的縮合物在456nm波長處的吸收度與供試溶液（不含丙酮）的吸收度相等，即△A456nm為零，對游離肼測定無干擾。若添加的丙酮量高于或低于3%時(shí)，均不能使異煙肼的△A456nm為零。
測定方法如下：
對照品溶液的制備與測定
供試品溶液的制備與測定
（二）尼可剎米中有關(guān)物質(zhì)檢查——TLC高低濃度對照法
四、含量測定
（一）異煙肼的含量測定
異煙肼含量測定方法的依據(jù)是：具有還原性和能與一些試劑縮合的酰肼基以及吡啶的堿性。常見的方法有溴酸鉀法、碘量法、溴量法、非水堿量法或酸量法、非水分光光度法及比色法。其中以溴酸鉀法、碘量法、溴量法最為常用。中國藥典（1963年版）曾采用溴量法測定異煙肼的含量。由于溴在稀考，試大收集整理鹽酸介質(zhì)中氧化異煙肼，剩余的溴液用碘量法進(jìn)行測定。本法因操作繁瑣、準(zhǔn)確度差等原因，故在1977年版藥典中改為溴酸鉀法。
1. 溴酸鉀法 我國藥典自1977年版改為在強(qiáng)酸性溶液中用溴酸鉀滴定液直接滴定法，用不可逆指示劑乙氧基黃叱精指示終點(diǎn)。由于本法操作簡單、準(zhǔn)確，1995年版仍用溴酸鉀法，但改用甲基橙指示劑指示終點(diǎn)；同時(shí)采用本法測定異煙肼片和注射劑的含量。
測定方法 取本品約0.2g，精密稱定，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取25ml，加水50ml、鹽酸20ml與甲基橙指示劑1滴，用溴酸鉀滴定液（0.01667mol/L）緩緩滴定（溫度保持在18～25℃）至粉紅色消失。每1ml的溴酸鉀滴定液（0.01667mol/L）相當(dāng)于3.429mg的C6H7N3O.
2.剩余碘量法
3.非水溶液滴定法
（二）異煙腙及尼可剎米的含量測定
1.非水溶液滴定法——異煙腙及其片劑；尼可剎米原料藥
2.紫外分光光度法——尼可剎米注射液
（三）丙硫異煙胺的含量測定
原料藥——非水溶液滴定法；片劑——銀量法